编者按：ALK基因融合在非小细胞肺癌中发生率虽然较低，但针对ALK基因改变的药物已被开发，而且显示出非常好的临床疗效，因此，非小细胞肺癌中ALK基因的准确检测对于患者的治疗非常有价值。本篇文章主要介绍非小细胞肺癌中ALK的临床意义，并对ALK基因不同检测方法的优缺点进行了相关的概述。
ALK融合基因检测的临床意义及检测方法
非小细胞肺癌约占肺癌的80-85%，是全球癌症相关死亡的主要原因。ALK 基因重排是NSCLC发生的驱动突变，已在5-6%的NSCLC病例中确定[1]。尽管有大量证据表明激活的ALK与这些肿瘤的形成有关，但最引人注意的还是ALK作为肿瘤治疗靶点中的关键是存在ALK的融合基因易位[2-3]。ALK突变似乎更常见于年轻患者和诊断为腺癌的从不吸烟者或轻度吸烟者。多个患者系列的数据显示，ALK阳性NSCLC患者的中位年龄为55岁，其中约70%的患者从不吸烟。全球男性和女性中ALK阳性NSCLC的发病率相似[4-5]。
ALK基因突变有重排（ALK-R）、扩增（ALK-A）和点突变三种类型。ALK基因的大多数突变以与另一伴侣基因易位的形式存在，导致融合癌基因。1994年，ALK最初在间变性大细胞淋巴瘤中被确定为染色体易位导致的核磷蛋白（NPM-ALK）的融合伴侣[6]。随后，在许多不同的癌症中发现了ALK重排（ALK-R），包括炎性肌纤维母细胞瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌（NSCLC）以及食管鳞状细胞癌、结直肠癌和乳腺癌[7-8]。ALK重排产生一种致癌性ALK酪氨酸激酶，可激活许多下游信号通路，导致细胞增殖和存活率增加。在与ALK基因的融合癌基因中发现了其他基因伴侣，包括TPM3、TFG、CLTCL1和ATIC[9]。
2007年在NSCLC中首次描述了ALK突变，当时发现一部分（7%）日本患者存在EML4–ALK重排，导致融合癌基因EML4-ALK[10]。据报道，在未经选择或选择的NSCLC患者中，ALK重排的发生率约为3%～13%。由于EML4上的断裂点不同，已描述了EML4-ALK突变的几种变体。EML4-ALK变异型为V1（54.5%）、V2（10%）、V3a/V3b（34%）和V5a（1.5%）[11-13]。
ALK重排可能涉及不同的断裂点和多个融合伴侣。因此，常规ALK检测具有重大的技术挑战。检测ALK重排的主要方法有四种：荧光原位杂交（FISH）、免疫组化（IHC）、逆转录酶-PCR（RT-PCR）和二代测序（NGS）。这些方法中的每一种都有优点和局限性。
荧光原位杂交断裂法被认为是评价ALK融合的金标准，是第一个获批用于检测断裂信号的ALK重排诊断试验，但IHC和RT-PCR也为此进行了评价，其中前者于2015年6月获得美国食品药品监督管理局（US FDA）批准。FISH是目前ALK检测最可靠的方法，但存在许多缺点。特别是，FISH需要经过广泛培训的人员和大量的时间培训，不能进行全自动化处理；此外，它在一些样本中表现出相对较高的失败率，在相当一部分NSCLC病例中可能提供难以解释的结果。尽管存在这些挑战，FISH仍被视为检测ALK重排的金标准以及为其他ALK检测方法的对照方法。
高灵敏度ALK诊断抗体的开发为标准化的免疫组化（IHC）方法检测ALK驱动的肿瘤提供了机会。与FISH和RT-PCR相比，IHC的主要优势之一是检测ALK蛋白，其是ALK抑制剂的靶点。IHC的优点是成本低、周转时间短、易于操作。IHC的原理是基于激活ALK重排伴随该酪氨酸激酶催化部分显著过表达的理论基础。IHC在标准实验室进行时通常能够产生高度可靠的结果；然而，它需要实验室的室间质控和方案标准化。使用D5F3抗体的Ventana ALK检测是检测ALK重排的有效方法。Ventana ALK（D5F3）CDx Assay（Ventana Medical Systems，Tucson，AZ，USA）于2015年获得美国FDA批准，作为ALK-TKI使用的伴随检测试验。59多项研究发现，Ventana IHC和FISH之间存在高度一致性[14]。
基于逆转录酶-PCR的检测方法在NSCLC ALK检测中的应用不如FISH和IHC广泛。然而，与FISH和IHC相比，常规RT-PCR具有显著优势。首先，虽然FISH和IHC检测到ALK易位存在的相对间接特征，但RT-PCR通常揭示重排的确切变体，因此提供了ALK融合的确切证据。再者，RT-PCR具有较高的敏感性和特异性，周转时间快，易于分析，在正常组织存在的情况下，可以检测到少量（1%）ALK驱动的NSCLC细胞。此外，RT-PCR分析使用与其他类型NSCLC分子诊断相同的技术平台，例如EGFR检测。最近开发了许多用于检测ALK重排的商业RT-PCR试剂盒，包括：ALK RGQ RT-PCR试剂盒 （Qiagen,Valencia,CA,USA）；EML4-ALK融合基因检测试剂盒 （Amoy Diagnostics，Xiamen，China）；和EML4 ALK基因融合PCR（Quest Diagnostics，Secaucus，NJ,USA）[15-16]。但该平台也存在一些缺点。首先，这种分析RNA样本的方法从福尔马林固定石蜡包埋标本中获得的RNA质量较差，只能检测已知的融合变异体。其次，高灵敏度可能导致假阳性结果。在以往的研究中，RT-PCR的敏感性和特异性分别为95.5%和87.0%，FISH与RT-PCR的一致率为89.0%。
二代测序是检测ALK基因重排的一种有前景的方法。NGS平台的巨大优势是检测已知的ALK基因融合。NGS也优于其他方法，因为它允许同时筛选新型ALK融合伴侣以及其他肺癌相关基因突变、融合和扩增。但在该方法应用于病理的正常实验室诊断之前，仍有许多挑战需要克服。例如，需要专业知识来分析和解释结果，成本和周转时间都很高。由于NGS尚未获得美国FDA批准，因此只能与其他方法联合使用。
综上，当对ALK融合基因进行筛选时，所有四种方法均显示出良好的灵敏度、特异性和一致性。然而，在临床实践中选择ALK重排检测的诊断方法仍然是一个有争议的问题。在不明确的情况下，应使用4种方法中的至少2种来确认ALK重排。
参考文献
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