编者按：晚期非小细胞肺癌除了常见的EGFR基因突变外，还存在一些少见或罕见的驱动基因突变，对这些基因也应选择相应的检测平台进行检测。为了让大家了解肺癌罕见基因检测的平台选择和检测方法，本文除了介绍常见EGFR基因检测外，重点介绍了肺癌少见和罕见驱动基因检测的平台和方法。
NCCN指南推荐晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者常见的基因异常类型为基因突变、基因过表达、基因融合等。一般情况下都应当进行肿瘤组织或脱落癌细胞的EGFR、ALK突变检测，以明确靶向药物的敏感位点和可能存在的耐药情况。对EGFR和ALK突变阴性的NSCLC患者可尝试进行ROS-1、RET、c-MET、PD-L1、NTRK及Her-2等罕见基因检测[1]。
常规EGFR和ALK的突变通常采用以下方法和平台：
1）EGFR点突变、插入/缺失：主要是EGFR L858R、EGFR-19del、EGFR T70M和EGFR-E20ins，是基于DNA水平上的改变，临床上常用的检测方法有ARMS-PCR、NGS、dPCR等。主要包括EGFR最主要的突变位点外显子19缺失（19del）和外显子21点突变（L858R），同时还包括外显子18点突变（G719X），外显子20插入突变（20ins）和点突变（T790M、S768I），外显子21点突变（L861Q）等。对于这些已知突变，常规组织样本推荐采用ARMS-PCR法，检测时间短且检测费用相对较低。基于qRT-PCR的方法，需要根据EGFR基因已知的突变类型设计引物探针，无法检测出所有可能的突变，但灵敏度相对较高，操作简单，无需对PCR产物进行操作，在很大程度上避免了扩增产物的污染，易于在临床开展，是目前EGFR 基因突变检测最常用的检测技术之一。二代测序是一种高通量测序技术，能够同时对多基因、多位点进行测序。二代测序检测EGFR基因突变，检测位点更加全面，可以发现罕见突变位点，为晚期NSCLC患者的全流程管理提供依据。
2）ALK基因重排/融合：ALK Ventana D5F3 IHC检测方法是目前最快速、经济的方法。该判读标准仅适用于肺腺癌，该检测在用于鳞癌、神经内分泌癌等其他类型肺癌标本时应谨慎，疑似阳性标本需要使用其他方法进行验证。FISH检测是检测ALK重排的“金标准”，检测结果判读直观，对样本质量要求较低，但费用较高、经济效益比不佳。并且在FISH判读时，对于处于临界值分离信号、不典型分离信号等的判定需要格外谨慎，推荐利用其他技术平台复核检测。基于qRT-PCR方法的ALK融合基因检测具有较高的灵敏度和特异度，但因为qRT-PCR只能检测已知ALK融合基因类型，所以存在假阴性。另外，由于qRT-PCR基于mRNA扩增技术，因此实验室内、外部质控等应制定最严格的技术标准，防止污染。二代测序对ALK基因融合通过捕获平台在DNA/RNA水平或扩增子平台在RNA水平上进行检测。但对于质控不合格或结果不典型病例，报告时应加备注，并建议使用其他技术平台进行复检。同时当二代测序在血液中检出ALK基因变异时，应注意假阴性结果的出现。
1）EGFR点突变、插入/缺失：主要是EGFR L858R、EGFR-19del、EGFR T70M和EGFR-E20ins，是基于DNA水平上的改变，临床上常用的检测方法有ARMS-PCR、NGS、dPCR等。主要包括EGFR最主要的突变位点外显子19缺失（19del）和外显子21点突变（L858R），同时还包括外显子18点突变（G719X），外显子20插入突变（20ins）和点突变（T790M、S768I），外显子21点突变（L861Q）等。对于这些已知突变，常规组织样本推荐采用ARMS-PCR法，检测时间短且检测费用相对较低。基于qRT-PCR的方法，需要根据EGFR基因已知的突变类型设计引物探针，无法检测出所有可能的突变，但灵敏度相对较高，操作简单，无需对PCR产物进行操作，在很大程度上避免了扩增产物的污染，易于在临床开展，是目前EGFR 基因突变检测最常用的检测技术之一。二代测序是一种高通量测序技术，能够同时对多基因、多位点进行测序。二代测序检测EGFR基因突变，检测位点更加全面，可以发现罕见突变位点，为晚期NSCLC患者的全流程管理提供依据。
2）ALK基因重排/融合：ALK Ventana D5F3 IHC检测方法是目前最快速、经济的方法。该判读标准仅适用于肺腺癌，该检测在用于鳞癌、神经内分泌癌等其他类型肺癌标本时应谨慎，疑似阳性标本需要使用其他方法进行验证。FISH检测是检测ALK重排的“金标准”，检测结果判读直观，对样本质量要求较低，但费用较高、经济效益比不佳。并且在FISH判读时，对于处于临界值分离信号、不典型分离信号等的判定需要格外谨慎，推荐利用其他技术平台复核检测。基于qRT-PCR方法的ALK融合基因检测具有较高的灵敏度和特异度，但因为qRT-PCR只能检测已知ALK融合基因类型，所以存在假阴性。另外，由于qRT-PCR基于mRNA扩增技术，因此实验室内、外部质控等应制定最严格的技术标准，防止污染。二代测序对ALK基因融合通过捕获平台在DNA/RNA水平或扩增子平台在RNA水平上进行检测。但对于质控不合格或结果不典型病例，报告时应加备注，并建议使用其他技术平台进行复检。同时当二代测序在血液中检出ALK基因变异时，应注意假阴性结果的出现。
其他涉及到的罕见基因主要由ROS1、RET基因重排/融合等，可以采用的检测方法有免疫组化、FISH、ARMS-PCR和NGS。其中RET突变可通过FISH或NGS检测，但也可通过IHC、逆转录PCR（RT-PCR）和循环肿瘤 DNA（ctDNA）检测。
1）ROS1基因重排/融合表达检测各种方法学与ALK相似，但IHC抗体特异性不佳，目前不能直接用于检测ROS1基因重排/融合表达，仅可用于ROS1基因融合初筛。基于qRT-PCR方法的ROS1融合基因检测具有较高的灵敏度和特异度，且可与ALK联检。FISH检测是检测ROS1重排的“金标准”。二代测序检测ROS1基因变异同样可在DNA水平上检测重排序列，也可在mRNA水平检测融合序列，但由于ROS1基因序列的特殊性，基于DNA水平的二代测序检测灵敏度受文库探针设计及生物信息学分析能力影响较大，应注意假阴性。
2）MET跳读突变：MET第14号外显子跳跃突变的检测，包括二代测序或qRT-PCR直接检测缺失MET第14号外显子的mRNA，或二代测序在DNA水平上检测可能导致MET第14号外显子剪切的基因变异。MET基因探针覆盖范围不够可能导致基于DNA的二代测序发生漏检，建议二代测序检测应尽量涵盖第14号外显子外的如第13或14号内含子上可能发生剪切变异的区域。原位杂交检测是检测MET扩增的标准方法。相较于FISH，二代测序可用于MET扩增检测，但与FISH检测的对应性比较复杂，并可能遗漏MET多体，但是二代测序可同时检测MET突变和融合等其他变异，且能实现多基因共检，在临床实践中应用更广。
3）蛋白过表达：NSCLC中蛋白过表达可用于指导临床靶向治疗的基因有HER、NTRK和PD-L1，通过IHC检测肿瘤细胞和/或免疫细胞PD-L1的表达水平是目前判断NSCLC患者能否从免疫检查点抑制剂治疗中得到更多获益的主要评估手段。目前我国已批准3种标准化的PD-L1检测商用试剂盒用于临床检测，包括配套Dako平台的PD-L1 IHC 22C3 pharmDx试剂盒及浓缩液、PD-L1 IHC 28-8 pharmDx试剂盒以及配套Ventana检测平台SP263试剂盒。不同单抗和IHC染色平台的使用、PD-L1染色阳性截断值的设定与相应的免疫治疗药物疗效相关。PD-L1检测所用抗体克隆不同其阳性阈值不同。除了上述靶分子外，HER2基因突变或扩增、BRAF突变、KRAS突变、RET基因重排、NTRK家族基因重排等的检测方法可参照基因点突变、基因重排类型的检测方法和检测策略，更多的尚需临床实践的积累。表1列举了非小细胞肺癌常用分子病理检测方法主要特点比较（表1）。
1）ROS1基因重排/融合表达检测各种方法学与ALK相似，但IHC抗体特异性不佳，目前不能直接用于检测ROS1基因重排/融合表达，仅可用于ROS1基因融合初筛。基于qRT-PCR方法的ROS1融合基因检测具有较高的灵敏度和特异度，且可与ALK联检。FISH检测是检测ROS1重排的“金标准”。二代测序检测ROS1基因变异同样可在DNA水平上检测重排序列，也可在mRNA水平检测融合序列，但由于ROS1基因序列的特殊性，基于DNA水平的二代测序检测灵敏度受文库探针设计及生物信息学分析能力影响较大，应注意假阴性。
2）MET跳读突变：MET第14号外显子跳跃突变的检测，包括二代测序或qRT-PCR直接检测缺失MET第14号外显子的mRNA，或二代测序在DNA水平上检测可能导致MET第14号外显子剪切的基因变异。MET基因探针覆盖范围不够可能导致基于DNA的二代测序发生漏检，建议二代测序检测应尽量涵盖第14号外显子外的如第13或14号内含子上可能发生剪切变异的区域。原位杂交检测是检测MET扩增的标准方法。相较于FISH，二代测序可用于MET扩增检测，但与FISH检测的对应性比较复杂，并可能遗漏MET多体，但是二代测序可同时检测MET突变和融合等其他变异，且能实现多基因共检，在临床实践中应用更广。
3）蛋白过表达：NSCLC中蛋白过表达可用于指导临床靶向治疗的基因有HER、NTRK和PD-L1，通过IHC检测肿瘤细胞和/或免疫细胞PD-L1的表达水平是目前判断NSCLC患者能否从免疫检查点抑制剂治疗中得到更多获益的主要评估手段。目前我国已批准3种标准化的PD-L1检测商用试剂盒用于临床检测，包括配套Dako平台的PD-L1 IHC 22C3 pharmDx试剂盒及浓缩液、PD-L1 IHC 28-8 pharmDx试剂盒以及配套Ventana检测平台SP263试剂盒。不同单抗和IHC染色平台的使用、PD-L1染色阳性截断值的设定与相应的免疫治疗药物疗效相关。PD-L1检测所用抗体克隆不同其阳性阈值不同。除了上述靶分子外，HER2基因突变或扩增、BRAF突变、KRAS突变、RET基因重排、NTRK家族基因重排等的检测方法可参照基因点突变、基因重排类型的检测方法和检测策略，更多的尚需临床实践的积累。表1列举了非小细胞肺癌常用分子病理检测方法主要特点比较（表1）。
表1 非小细胞肺癌常用分子病理检测方法主要特点比较
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