编者按：间变性淋巴瘤激酶（ALK）是肺癌发生发展的重要驱动基因之一，也是目前非小细胞肺癌（NSCLC）治疗的“黄金靶点”。ALK检测结果的准确性对于临床治疗方案的选择至关重要。本文针对肺癌ALK检测中的一些问题如检测的适用人群、ALK基因异常类型、ALK检测方法及判读标准以及检测临床实践中相关注意事项进行了比较详细的介绍。

　　间变性淋巴瘤激酶（ALK）是肺癌发生发展的重要驱动基因之一，也是目前非小细胞肺癌（NSCLC）治疗的“黄金靶点”。ALK基因融合在我国NSCLC中的发生率约5.6%，其中腺 癌的发生率为6.6%~9.6%。因此，准确鉴定出ALK融合的NSCLC，并给予精准靶向治疗是提高患者生存的最佳手段。然而，由于ALK基因融合发生频率较低且融合形式多样，如何精准有效的检测出ALK融合基因一直是困扰临床医生的难题。为此《中国非小细胞肺癌ALK检测临床实践专家共识》、《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南》等共识及指南相继出台，为NSCLC中ALK的精准检测以及治疗提供了指导方案。

　　ALK检测的临床意义

　　ALK属于受体型蛋白酪氨酸激酶（PTKs）家族，与肿瘤的发生密切相关，被认为是肿瘤的驱动基因。近年来ALK抑制剂的研发和临床应用取得重大突破，伴有ALK基因融合的晚期NSCLC患者接受ALK抑制剂治疗时，客观缓解率和PFS显著优于含铂化疗；而ALK阴性患者不能从ALK抑制剂中获益。其次，对于初治ALK阳性晚期非小细胞肺癌患者，ALK抑制剂疗效显著优于传统化疗方案，同时ALK抑制剂相关不良反应较轻微，显著改善了患者的生活质量。另外，伴有ALK基因融合的NSCLC手术患者与预后较差相关，无复发生存时间较短。研究表明，手术切除的NSCLC患者，ALK阳性比EGFR突变患者的RFS更短，提示ALK阳性患者术后应采取更积极的随诊计划或进行辅助治疗。

　　ALK检测的适用人群

　　在我国，未经选择的NSCLC中ALK阳性的病例约占5.6%，其中肺腺癌阳性率约6.6%~9.6%，且晚期患者阳性率高于早期患者。对于晚期肺腺癌患者，ALK基因检测能够有效筛选ALK抑制剂获益人群；对于手术切除患者，ALK阳性患者的预后较差。因此，推荐经病理学诊断为肺浸润性腺癌（包括含腺癌成分）的患者，不管其分期，均需进行ALK基因检测。此外，ALK基因融合可在肺鳞状细胞癌中检出，我国肺鳞状细胞癌中ALK基因融合发生率可达3.7%。有多个研究显示肺鳞状细胞癌中可出现EML4-ALK基因融合，且可在接受ALK抑制剂治疗中获益。因此推荐经活检组织病理学诊断为非腺癌的晚期NSCLC患者可以进行ALK检测，以期筛选出ALK阳性患者获得更佳治疗方案。

　　ALK基因异常类型

　　初治患者进行ALK基因检测时，需检测是否存在基因易位/融合/表达，可进行ALK融合变体亚型检测及易位丰度检测。目前至少发现了20多种EML4-ALK融合变体亚型，最常见的是EML4的变体1和变体 3v3a/b，所有的变体都保留了ALK的整个酪氨酸激酶结构域和EML4的N末端卷曲螺旋区域，这对于ALK的激活是必不可少的。ALK除最常见与EML4融合外，也可以与TFG、KLC1、SOCS5、H1P1、TPR、BIRC6等基因融合。研究结果显示，不同的变异亚型可能与抗ALK治疗的PFS时间相关，但由于研究人群以及药物的差异性，不同研究结果存在差异，因此，这些复杂的ALK变异类型及其临床意义尚待我们进一步研究。

　　ALK检测方法及判读标准

　　目前，我国批准了4个技术平台的ALK基因检测伴随诊断试剂盒，包括ALK Ventana-D5F3 IHC、FISH、RT-PCR、NGS检测平台。研究结果显示，这4个技术平台检测试剂均具有较高的灵敏度及特异性，均可用于ALK基因融合检测。

　　1.ALK IHC检测目前有4种ALK抗体克隆，包括ALK1、5A4、D5F3 以及1A4。其中ALK Ventana-D5F3 IHC检测方法是目前最快速、经济的方法，其灵敏度及特异度高，且判读标准简单。因此建议使用ALK D5F3作为伴随诊断检测，而非Ventana D5F3的检测仅用于ALK检测结果初筛。其次，ALK Ventana D5F3 IHC结果判读中存在一些陷阱，可能会出现假阳性或假阴性的情况，判读时要注意以下几点：（1）整体染色情况（间质背景是否干净）；（2）阳性信号位于胞质或者胞质和胞膜，细胞核不应着色；（3）染色是否相对均匀（ALK异质性少见），胞质内的着色也相对均匀；（4）注意腔缘效应以及黏液、坏死等导致的非特异性着色。另外对于非腺癌患者，在进行ALK Ventana-D5F3 IHC结果判读时需要格外谨慎，必要时可加备注进一步说明或建议使用其他技术平台进行验证。

　　2.FISH检测 FISH检测是ALK基因易位经典的检测方法。但由于EML4-ALK易位是倒置易位，有些病例荧光分离信号距离较近，且断裂点附近不稳定，会产生染色体崩塌导致距离更近，可造成假阴性判读结果。另外，在试剂盒判读标准中，ALK单绿信号（5′端荧光信号）是被判为阴性的，但有研究显示，部分此类病例可出现ALK基因融合表达，且对ALK抑制剂治疗有效。因此，对于FISH信号不典型或分离信号肿瘤细胞比例在临界值附近的病例，判读应谨慎，必要时加备注，并建议使用其他技术平台进行复检。

　　3.RT-PCR检测 基于RT-PCR检测ALK融合基因表达方法的灵敏度和特异度均较强，但因为RT-PCR只能检测已知ALK融合基因类型，所以存在假阴性可能。同时，因涉及基于mRNA的PCR扩增，其对于检测环境和标本质量都有比较高的要求，因此应强化内、外部质控，避免污染。对于Ct值在阈值范围附近的患者，在进行结果判读时需要谨慎对待，需结合标本质量、肿瘤细胞含量、质控情况等综合分析。

　　4.NGS检测  目前NGS在基因检测中的地位越来越高，可以检测点突变和基因易位，同时可以和其他基因一起检测。一般情况下，ALK基因融合通过捕获平台在DNA水平或扩增子平台在RNA水平上进行检测。基于捕获平台检测结果的灵敏度和特异度均很高，而且能够检测到包括已知和未知位点在内的所有ALK易位，但是其准确性可能会受捕获探针的覆盖度、标本DNA质量，以及生物信息学分析等关键因素影响。NGS检测流程复杂，影响因素繁多。在进行ALK结果判读时，应充分掌握NGS检测平台及试剂的特点和局限性，并结合标本情况及测序数据等进行综合判读。

　　ALK检测临床实践中相关注意事项

　　1. 多种样本均可用于ALK基因融合检测，首先推荐石蜡包埋的肿瘤组织样本进行检测，但手术样本保存时间过长或未经过规范化前处理的标本可能影响检测结果。晚期肺癌患者无法获取肿瘤组织标本时，细胞学样本经病理学评估肿瘤细胞量满足需要时，推荐用于ALK检测。对于少数晚期非小细胞肺癌患者无法获得组织学或细胞学样本的，可以尝试使用血液/脑脊液进行ALK检测。

　　2.ALK IHC、FISH、RT-PCR、NGS各检测平台对肿瘤细胞含量均有一定的要求，如FISH检测判读标准要求至少判读100个肿瘤细胞，而以PCR为基础的RT-PCR技术和NGS技术，不仅需要一定的细胞量，同时需满足一定的肿瘤细胞比例，只有满足要求才能保证检测结果的准确性。

　　3.当存在IHC、FISH、RT-PCR、NGS检测结果不一致时，临床医师应与检测医师或相关人员充分沟通，确保检测结果均无异议时，才可进行ALK抑制剂的治疗。
参考文献：