编者按：《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南(2021版)》近期已在《中华病理学杂志》发表。本指南基于国内临床实践数据及结合中国国情，以国内上市治疗药物及体外诊断检测试剂为导向制定，重在对分子病理检测实践的指导。为了更好地让读者理解指南，阿斯利康联合91360智慧病理网邀请国内临床及病理专家就本指南中的相关问题进行解读。本期91360智慧病理网邀请苏州大学附属第一医院病理科郭凌川主任对NSCLC常见的和罕见的分子基因改变、NSCLC中分子基因改变的检测方法进行相关介绍。
郭凌川教授
医学博士，主任医师/副教授/博士生导师苏州大学附属第一医院病理科主任
中华医学会病理学分会委员
江苏省医学会病理学分会主任委员
中华医学会病理学分会淋巴瘤专业学组副组长
中国临床肿瘤学会（CSCO）肿瘤病理专委会常委
中国医疗保健国际交流促进会病理专委会常委
中国病理学工作者委员会常务委员
中国医学装备协会病理装备分会常务委员
中国医学装备协会病理诊断部副部长
江苏省医师协会病理分会副会长
江苏省病理质控中心副主任
江苏省抗癌协会病理学分会副主任委员
中华医学会病理学分会分子病理学组委员
中国抗癌协会淋巴瘤专委会委员
中国抗癌协会乳腺病理学组委员
非小细胞肺癌中靶向治疗的分子靶点概况及其检测方法
近年来，随着分子病理诊断技术及靶向药物研发不断进步，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的靶向治疗获得了长足进展，NSCLC患者术后靶向治疗的客观缓解率及无进展生存时间显著延长，生活质量也稳步提高。研究确定我国NSCLC患者常见的基因突变类型，选择准确、快速、价格具有优势的基因检测方法，筛选适合靶向用药的患者对NSCLC临床诊疗具有积极意义。
1.NSCLC常见的分子基因改变
我国NSCLC患者的分子病理特征与国外人群有所区别。其中，肺腺癌常见的变异基因包括表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR，45%-55%）、KRAS（8%-10%）、间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK，5%-10%）。上述基因变异中，EGFR第18-21号外显子点突变、缺失、插入已成为国内外NSCLC治疗指南推荐的必检基因。EGFR在NSCLC患者肿瘤组织中具有高频突变，针对其突变的吉非替尼等酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors，TKIs）已获批上市并在临床治疗中取得良好预后。此外，针对ALK基因的重排及融合变异，靶向抑制剂克唑替尼等也于近年上市并应用于ALK突变的NSCLC患者靶向治疗，取得较好效果。值得注意的是，尽管KRAS在NSCLC患者中也具有高频突变，但KRAS靶向抑制剂研发困难，目前仅有少数研发中药物在NSCLC患者治疗临床实验取得一定效果，有待继续推进。
2.NSCLC少见的分子基因改变
除上述高频突变外，NSCLC患者还常检出少见变异基因，包括ROS1（2%-3%）、MET（2%-4%）、HER2（2%-4%）、BRAF（1%-2%）、RET（1%-4%），以及罕见变异基因NTRK（<1%）、NRG1/2（<1%）、FGFR2（<1%）等。但上述基因变异在NSCLC中的意义仍有待进一步明确，其靶向治疗药物在国内上市较少，效果同样有待证实。此外，其他分子基因改变如高度微卫星不稳定（MSI-H）在NSCLC中较为罕见。
3.NSCLC分子基因改变的检测方法
针对上述NSCLC中的分子基因改变，分子病理常见的检测方法包括免疫组织化学方法、荧光原位杂交技术、qRT-PCR技术、Sanger测序技术、二代测序技术等。这些检测方法均具有不同的优缺点，同时与肿瘤基因突变类型、突变基因丰度、样本质量、实验室条件等多种因素有关。应用上述两种或多种检测技术共同诊断有助于结果互补及验证，具体检测方法介绍如下。
3.1 免疫组织化学方法
免疫组织化学染色在分子病理诊断中应用较少，但是其作为上述方法中，唯一能够检测蛋白表达水平的方法具有重要意义。如利用免疫组化检测HER2基因扩增检测在乳腺癌分子分型中已成为常用技术。在肺癌中，ALK突变及融合通过免疫组织化学诊断能够有效确认ALK重组蛋白存在，是ALK基因变异分子病理诊断的可靠标准之一。
3.2 荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术（FISH）在基因断裂重排检测中具有重要意义。如利用FISH技术在DNA水平检测ALK基因重排已成为ALK分子病理检测金标准。检测结果判读直观，对样本量要求低。但该检测中，FISH判读对病理医师要求较高，在应用时推荐联合其他平台如qRT-PCR及测序技术复检。此外，FISH技术在ROS1重排、MET扩增等分子基因改变检测中具有重要作用。
3.3 qRT-PCR技术
荧光定量PCR（qRT-PCR）技术针对基因突变、重排/融合检测均具有重要作用，其通过不同引物组合，能够实现对有限的已知基因突变开展联合检测，检测费用相对较低。如EGFR T790M耐药突变、ALK/ROS1融合基因mRNA检测、MET外显子跳跃突变检测等，均可以应用qRT-PCR技术检测。但应注意基于mRNA扩增技术的qRT-PCR对实验室质控、防止样本污染等操作要求较高。此外，qRT-PCR检测准确性受捕获探针覆盖区域、样本质量等多种因素影响。
3.4 Sanger测序技术
相较于qRT-PCR，Sanger测序能够直接检测已知突变与未知突变，在早期EGFR突变检测中应用较多。但Sanger测序法灵敏度较低，操作步骤复杂，且样本容易受到污染，其应用于EGFR等基因突变频率较高，种类较多的基因检测受到限制。
3.5 二代测序技术
二代测序是一种高通量测序技术，能够针对多基因、多位点进行测序。除实验操作之外，二代测序数据下机后对生物信息学分析部分也具有较高要求。包括测序后数据的质量分析、比对、变异识别、基因注释、结果报告与解读分析等。相较于传统测序技术，二代测序通量高，信息量丰富，能够鉴定罕见位点。但其更长的操作流程及后期数据分析对分子病理从业人员提出了更高要求。
小结
NSCLC发病率逐年升高，其中肿瘤基因突变检测对NSCLC患者预后及靶向用药具有重要意义。应用上述不同检测方法，在评估不同患者诊疗过程中，包括时效性、基因数目、样本质量等因素综合考虑，能够为NSCLC患者分子病理诊断及靶向治疗提供更多帮助。
参考文献
1，非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南（2021版）。中华病理学杂志，2021, 50(4):323-332。
2，Mitsudomi T, Morita S, Yatabe Y, et al. Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-celllung cancer harboring mutations of the epidermal growth factor receptor (WJTOG3405): an open label, randomized phase 3 trial[J]. Lancet Oncol, 2010, 11(2): 121-128. DOI: 10.1016/S1470-2045(09)70364-X.
3，Pennell NA, Arcila ME, Gandara DR, et al. Biomarker testing for patients with advanced non-small cell lung cancer: real-world issues and tough choices[J]. Am Soc Clin Oncol Educ Book, 2019, 39:531-542.
4，中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家组. 中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家共识. 中华病理学杂志, 2011, 40 (10):700-702.
5，张绪超, 陆舜, 张力, 等. 中国间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性非小细胞肺癌诊疗指南. 中华病理学杂志, 2015, 44(10):696-703.
1.NSCLC常见的分子基因改变
我国NSCLC患者的分子病理特征与国外人群有所区别。其中，肺腺癌常见的变异基因包括表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR，45%-55%）、KRAS（8%-10%）、间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK，5%-10%）。上述基因变异中，EGFR第18-21号外显子点突变、缺失、插入已成为国内外NSCLC治疗指南推荐的必检基因。EGFR在NSCLC患者肿瘤组织中具有高频突变，针对其突变的吉非替尼等酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors，TKIs）已获批上市并在临床治疗中取得良好预后。此外，针对ALK基因的重排及融合变异，靶向抑制剂克唑替尼等也于近年上市并应用于ALK突变的NSCLC患者靶向治疗，取得较好效果。值得注意的是，尽管KRAS在NSCLC患者中也具有高频突变，但KRAS靶向抑制剂研发困难，目前仅有少数研发中药物在NSCLC患者治疗临床实验取得一定效果，有待继续推进。
2.NSCLC少见的分子基因改变
除上述高频突变外，NSCLC患者还常检出少见变异基因，包括ROS1（2%-3%）、MET（2%-4%）、HER2（2%-4%）、BRAF（1%-2%）、RET（1%-4%），以及罕见变异基因NTRK（<1%）、NRG1/2（<1%）、FGFR2（<1%）等。但上述基因变异在NSCLC中的意义仍有待进一步明确，其靶向治疗药物在国内上市较少，效果同样有待证实。此外，其他分子基因改变如高度微卫星不稳定（MSI-H）在NSCLC中较为罕见。
3.NSCLC分子基因改变的检测方法
针对上述NSCLC中的分子基因改变，分子病理常见的检测方法包括免疫组织化学方法、荧光原位杂交技术、qRT-PCR技术、Sanger测序技术、二代测序技术等。这些检测方法均具有不同的优缺点，同时与肿瘤基因突变类型、突变基因丰度、样本质量、实验室条件等多种因素有关。应用上述两种或多种检测技术共同诊断有助于结果互补及验证，具体检测方法介绍如下。
3.1 免疫组织化学方法
免疫组织化学染色在分子病理诊断中应用较少，但是其作为上述方法中，唯一能够检测蛋白表达水平的方法具有重要意义。如利用免疫组化检测HER2基因扩增检测在乳腺癌分子分型中已成为常用技术。在肺癌中，ALK突变及融合通过免疫组织化学诊断能够有效确认ALK重组蛋白存在，是ALK基因变异分子病理诊断的可靠标准之一。
3.2 荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术（FISH）在基因断裂重排检测中具有重要意义。如利用FISH技术在DNA水平检测ALK基因重排已成为ALK分子病理检测金标准。检测结果判读直观，对样本量要求低。但该检测中，FISH判读对病理医师要求较高，在应用时推荐联合其他平台如qRT-PCR及测序技术复检。此外，FISH技术在ROS1重排、MET扩增等分子基因改变检测中具有重要作用。
3.3 qRT-PCR技术
荧光定量PCR（qRT-PCR）技术针对基因突变、重排/融合检测均具有重要作用，其通过不同引物组合，能够实现对有限的已知基因突变开展联合检测，检测费用相对较低。如EGFR T790M耐药突变、ALK/ROS1融合基因mRNA检测、MET外显子跳跃突变检测等，均可以应用qRT-PCR技术检测。但应注意基于mRNA扩增技术的qRT-PCR对实验室质控、防止样本污染等操作要求较高。此外，qRT-PCR检测准确性受捕获探针覆盖区域、样本质量等多种因素影响。
3.4 Sanger测序技术
相较于qRT-PCR，Sanger测序能够直接检测已知突变与未知突变，在早期EGFR突变检测中应用较多。但Sanger测序法灵敏度较低，操作步骤复杂，且样本容易受到污染，其应用于EGFR等基因突变频率较高，种类较多的基因检测受到限制。
3.5 二代测序技术
二代测序是一种高通量测序技术，能够针对多基因、多位点进行测序。除实验操作之外，二代测序数据下机后对生物信息学分析部分也具有较高要求。包括测序后数据的质量分析、比对、变异识别、基因注释、结果报告与解读分析等。相较于传统测序技术，二代测序通量高，信息量丰富，能够鉴定罕见位点。但其更长的操作流程及后期数据分析对分子病理从业人员提出了更高要求。
小结
NSCLC发病率逐年升高，其中肿瘤基因突变检测对NSCLC患者预后及靶向用药具有重要意义。应用上述不同检测方法，在评估不同患者诊疗过程中，包括时效性、基因数目、样本质量等因素综合考虑，能够为NSCLC患者分子病理诊断及靶向治疗提供更多帮助。
参考文献
1，非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南（2021版）。中华病理学杂志，2021, 50(4):323-332。
2，Mitsudomi T, Morita S, Yatabe Y, et al. Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-celllung cancer harboring mutations of the epidermal growth factor receptor (WJTOG3405): an open label, randomized phase 3 trial[J]. Lancet Oncol, 2010, 11(2): 121-128. DOI: 10.1016/S1470-2045(09)70364-X.
3，Pennell NA, Arcila ME, Gandara DR, et al. Biomarker testing for patients with advanced non-small cell lung cancer: real-world issues and tough choices[J]. Am Soc Clin Oncol Educ Book, 2019, 39:531-542.
4，中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家组. 中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家共识. 中华病理学杂志, 2011, 40 (10):700-702.
5，张绪超, 陆舜, 张力, 等. 中国间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性非小细胞肺癌诊疗指南. 中华病理学杂志, 2015, 44(10):696-703.
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