编者按：肺癌是当今世界严重危害人类健康的恶性肿瘤，分子技术和精准靶向药物大大改变了晚期NSCLC的治疗格局。肺癌的靶向治疗离不开肺癌的分子靶点检测，分子检测涉及到各个方面，任何一个因素都可能影响分子检测结果准确性。为了规范肺癌的分子检测，AZ联合国内相关专家对肺癌分子检测的样本要求、技术平台、检测内容与规范和检测观念进行全面阐述。本期91360智慧病理网邀请广东省肺癌研究所张绪超教授先简要介绍近些年来最新NSCLC中基因靶向药物进展，然后重点阐述NSCLC中靶向药物相关基因的检测方法及其优缺点，探讨基因检测的策略。
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张绪超教授
博士，博士生导师。广东省人民医院（广东省医学科学院）医学研究中心主任、华南理工大学第一临床学院广东省肺癌研究所研究员、广东省肺癌转化医学重点实验室副主任、2018广东省杰出青年医学人才、兼任中国临床肿瘤学会（CSCO）理事会常务理事、CSCO肿瘤生物标志物专家委员会秘书、广东省转化医学会肿瘤学分会主任委员、广东省抗癌协会肺癌专业委员会常委、广东省抗癌协会靶向治疗专业委员会副主任委员、广东省抗癌协会分子诊断委员会候任主任委员、广东省药理学会肿瘤药理专业委员会副主任委员、美国临床肿瘤学会（ASCO）会员、美国癌症研究协会（AACR）会员、欧洲肿瘤内科学会（ESMO）会员、国际肺癌研究协会（IASLC）会员。
2.NSCLC靶向药物相关基因异常类型 研究方向为肿瘤的分子标志物与转化应用研究，主要涉及癌症预测预后分子标志物、肿瘤的细胞与分子异质性、肿瘤免疫微环境、癌症转移机制、肿瘤遗传变异检测技术等。着重在肿瘤的临床分子靶点和相关信号通路分析及肿瘤进化和耐药机制方面开展研究。获得国家自然科学基金2项，省部级科研基金多项。参与“863”课题、卫计委行业专项及国家自然科学基金多项。
参与获得国家科技进步奖二等奖1项、中华医学会医学科技一等奖1项、广东省科技成果奖3项。在Science增刊发表综述，在Nature Communications、Journal of Clinical Oncology、Annual of Oncology、Clinical Cancer Research、Journal of Thoracic Oncology、Molecular Cancer等杂志以共同第一作者、第一作者或参与作者发表SCI文章五十余篇。作为主要完成人获得国家发明专利2项。主要参与制定CSCO 肺癌主要驱动基因EGFR、ALK、临床NGS技术应用等检测共识制定。研究论文获得“CSCO中国肺癌学术翘楚奖”、中华医学会呼吸病分会“高影响力呼吸学术论文奖”。
肺癌靶向治疗新进展及相关基因检测
随着对NSCLC驱动基因的研究不断深入，针对这些驱动基因改变的靶向药物陆续被研发并在临床进行相关的研究试验。临床试验显示针对这些驱动基因的靶向药物展现出令人满意或振奋的治疗效果。下面我们就2021WCLC和ESMO会议上报道的一些新的靶向药物研究新进展情况进行简要介绍，并对这些驱动基因的检测方法进行概括。
1.NSCLC中分子靶向药物
《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南》（2021版）（下称《指南 》）指出，NSCLC除了常见的EGFR、KRAS、ALK等基因，还有一些少见变异基因如ROS1、MET、HER2、BRAF、RET等，以及罕见基因变异如NTRK、NRG1/2和FGFR2等[1]。针对上述基因变异的靶向药物近些年研发也取得了很大的成绩。
除了诸多已经广泛应用于临床的药物外，一批新药也随着临床研究的进展得以获批。CodeBreak 100研究中证实了索托拉西布对KRAS G12C突变NSCLC有效，掀起了对KRAS药物研发的热潮。RAF/MEK抑制剂VS-6766对KRAS突变尤其是G12V突变的肺癌具有初步显效。近两年成功出现的靶点中，RET是代表性靶点。依托LIBETTO研究和ARROW研究，selpercatinib（塞尔帕替尼）和pralsetinib（普拉替尼）先后获批，开启了RET肺癌的靶向治疗大门。此外，国内外已上市多款用于MET 14外显子跳读突变NSCLC患者的MET抑制剂，如赛沃替尼（Savolitinib）、卡马替尼（Capmatinib）、特普替尼（Tepmetko, Tepotinib）等。随着EGFR/MET双抗amivantamab（JNJ6372）在20ins的获批，EGFR 20ins成为了独立于EGFR常见突变（19和21外显子突变）之外的“新靶点“，有着自己的药物发展谱。常见的是amivantamab、Mobecetinib（TAK788）、波奇替尼。NSCLC中HER2基因变异主要分为基因扩增和基因突变，后者主要为外显子20插入突变。针对HER2变异的药物先后有阿法替尼、达克替尼、吡咯替尼、TAK-788、T-DM1等。NTRK作为肺癌新兴靶向和罕见靶点，中国一项研究发现NTRK突变率为0.19%，其中NTRK1为0.11%，NTRK2为0.02%，NTRK3为 0.06%。目前针对NTRK基因变异的靶向药物有拉罗替尼（LOXO-101）、LOXO-195和Entrectinib（RXDX-101）。
《指南 》中对NSCLC药物相关靶点基因也进行了汇总，NSCLC中靶向药物相关基因变异主要有以下几种类型，其检测级别也有伴随诊断及补充诊断等不同。
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目前，最常见的肺癌分子亚型有：1.EGFR基因变异类型：EGFR基因变异包括基因突变（点突变、插入/缺失突变），主要发生在编码EGFR酪氨酸激酶区的第18~21号外显子，以及获得性耐药突变（包括第一、二代TKI 的耐药突变T790M 和第三代TKI 的耐药突变C797S 等）。EGFR 基因扩增对选择TKI 治疗目前无明确临床意义。2. ALK基因变异类型：ALK基因变异类型包括基因重排/融合，以及获得性耐药突变（点突变为主）。目前至少发现了20 多种EML4?ALK 融合变异亚型。此外还有更多少见/罕见的ALK融合伴侣不断被发现。3. ROS1 基因变异类型：ROS1 基因变异包括ROS1基因重排。目前共发现十余种ROS1基因融合伴侣，主要包括CD74、SLC34A2、CCDC6、TPM3、EZR等，其断裂位点主要位于ROS1基因的第32~36号外显子。4.MET 基因变异类型：在NSCLC 的临床实践中，根据已有的循证医学证据，目前主要关注MET第14号外显子跳跃突变和MET扩增的检测。5. 除此以外，HER2、BRAF、KRAS、RET、NTRK等：除了上述靶分子外，HER2基因突变或扩增、BRAF突变、KRAS突变、RET基因重排、NTRK家族基因重排等，均为NSCLC中重要的驱动基因变异，并是潜在的治疗靶点。6. PD-L1表达检测：通过IHC检测肿瘤细胞和/或免疫细胞PD-L1的表达水平是目前判断NSCLC患者能否从免疫检查点抑制剂治疗中得到更多获益的主要评估手段。
针对上述NSCLC 中基因变异检测，常见的分子病理检测方法包括Sanger测序、FISH、qRT PCR、IHC、二代测序技术等。而《指南》[1]中对于不同的靶基因也给出了相应的检测方法及解决策略：
目前，最常见的肺癌分子亚型有：1.EGFR基因变异类型：EGFR基因变异包括基因突变（点突变、插入/缺失突变），主要发生在编码EGFR酪氨酸激酶区的第18~21号外显子，以及获得性耐药突变（包括第一、二代TKI 的耐药突变T790M 和第三代TKI 的耐药突变C797S 等）。EGFR 基因扩增对选择TKI 治疗目前无明确临床意义。2. ALK基因变异类型：ALK基因变异类型包括基因重排/融合，以及获得性耐药突变（点突变为主）。目前至少发现了20 多种EML4?ALK 融合变异亚型。此外还有更多少见/罕见的ALK融合伴侣不断被发现。3. ROS1 基因变异类型：ROS1 基因变异包括ROS1基因重排。目前共发现十余种ROS1基因融合伴侣，主要包括CD74、SLC34A2、CCDC6、TPM3、EZR等，其断裂位点主要位于ROS1基因的第32~36号外显子。4.MET 基因变异类型：在NSCLC 的临床实践中，根据已有的循证医学证据，目前主要关注MET第14号外显子跳跃突变和MET扩增的检测。5. 除此以外，HER2、BRAF、KRAS、RET、NTRK等：除了上述靶分子外，HER2基因突变或扩增、BRAF突变、KRAS突变、RET基因重排、NTRK家族基因重排等，均为NSCLC中重要的驱动基因变异，并是潜在的治疗靶点。6. PD-L1表达检测：通过IHC检测肿瘤细胞和/或免疫细胞PD-L1的表达水平是目前判断NSCLC患者能否从免疫检查点抑制剂治疗中得到更多获益的主要评估手段。
3.肺癌相关基因检测方法
肺癌靶向治疗主要依赖于驱动基因靶点的准确诊断。NCCN指南推荐晚期NSCLC患者需要进行EGFR、ALK、ROS1、RET、MET、HER2、BRAF、NTRK、PD-L1等9个基因检测。
（1）EGFR基因突变常用检测方法：目前EGFR基因突变临床常用的检测方法包括Sanger测序法、qRT PCR法和二代测序等。主要包括EGFR最主要的突变位点外显子19缺失（19del）和外显子21点突变（L858R），同时还包括外显子18点突变（G719X），外显子20插入突变（20ins）和点突变（T790M、S768I），外显子21 点突变（L861Q）等。Sanger 测序法是直接可检测已知和未知突变的一种方法，是早期广泛应用的EGFR 基因突变检测方法。但Sanger 测序法检测EGFR基因突变的灵敏度较低，操作步骤复杂、容易产生污染，已不能完全满足临床EGFR基因突变检测的需求。基于qRT PCR 的方法，需要根据EGFR基因已知的突变类型设计引物探针，无法检测出所有可能的突变，但灵敏度相对较高，操作简单，无需对PCR产物进行操作，在很大程度上避免了扩增产物的污染，易于在临床开展，是目前EGFR 基因突变检测最常用的检测技术之一。二代测序是一种高通量测序技术，能够同时对多基因、多位点进行测序。二代测序检测EGFR基因突变，检测位点更加全面，可以发现罕见突变位点，为晚期NSCLC患者的全流程管理提供依据。
（2）ALK 基因变异常用检测方法：ALK 基因重排导致ALK 融合基因的表达，可以用FISH、 qRT PCR 、IHC以及二代测序等方法检测。ALK Ventana D5F3 IHC检测方法是目前最快速、经济的方法。该判读标准仅适用于肺腺癌，该检测在用于鳞癌、神经内分泌癌等其他类型肺癌标本时应谨慎，疑似阳性标本需要使用其他方法进行验证。FISH检测是检测ALK重排的“金标准”，检测结果判读直观，对样本质量要求较低，但费用较高、经济效益比不佳。并且在FISH判读时，对于处于临界值分离信号、不典型分离信号等的判定需要格外谨慎，推荐利用其他技术平台复核检测。基于qRT PCR方法的ALK融合基因检测具有较高的灵敏度和特异度，但因为qRT PCR 只能检测已知ALK 融合基因类型，所以存在假阴性。另外，由于qRT PCR基于mRNA扩增技术，因此实验室内、外部质控等应制定最严格的技术标准，防止污染。二代测序对ALK基因融合通过捕获平台在DNA/RNA水平或扩增子平台在RNA水平上进行检测。但对于质控不合格或结果不典型病例，报告时应加备注，并建议使用其他技术平台进行复检。同时当二代测序在血液中检出ALK基因变异时，应注意假阴性结果的出现。
（3）ROS1基因检测方法：ROS1基因重排/融合表达检测各种方法学与ALK 相似，但IHC 抗体特异性不佳，目前不能直接用于检测ROS1基因重排/融合表达，仅可用于ROS1基因融合初筛。基于qRT PCR方法的ROS1融合基因检测具有较高的灵敏度和特异度，且可与ALK联检。FISH检测是检测ROS1重排的“金标准”。二代测序检测ROS1基因变异同样可在DNA水平上检测重排序列，也可在mRNA水平检测融合序列，但由于ROS1基因序列的特殊性，基于DNA水平的二代测序检测灵敏度受文库探针设计及生物信息学分析能力影响较大，应注意假阴性。
（4）PD L1表达检测：通过IHC检测肿瘤细胞和/或免疫细胞PD L1的表达水平是目前判断NSCLC患者能否从免疫检查点抑制剂治疗中得到更多获益的主要评估手段。目前我国已批准3种标准化的PD L1检测商用试剂盒用于临床检测，包括配套Dako平台的PD L1 IHC 22C3 pharmDx试剂盒及浓缩液、PD L1 IHC 28 8 pharmDx 试剂盒以及配套Ventana检测平台SP263试剂盒。不同单抗和IHC染色平台的使用、PD L1染色阳性截断值的设定与相应的免疫治疗药物疗效相关。PD L1 检测所用抗体克隆不同其阳性阈值不同。
（5）MET基因变异的常用检测方法：MET第14号外显子跳跃突变的检测，包括二代测序或qRT PCR直接检测缺失MET第14号外显子的mRNA，或二代测序在DNA 水平上检测可能导致MET第14号外显子剪切的基因变异。MET 基因探针覆盖范围不够可能导致基于DNA的二代测序发生漏检，建议二代测序检测应尽量涵盖第14号外显子外的如第13或14号内含子上可能发生剪切变异的区域。原位杂交检测是检测MET扩增的标准方法。相较于FISH，二代测序可用于MET扩增检测，但与FISH检测的对应性比较复杂，并可能遗漏MET多体，但是二代测序可同时检测MET突变和融合等其他变异，且能实现多基因共检，在临床实践中应用更广。高水平MET扩增在NCCN指南中被纳入作为靶向药物的适应证。目前有趋势显示平均肿瘤细胞内的MET拷贝数（GCN）可能是个较好的指标，这个指标兼顾了病灶中肿瘤细胞比例及生物技术的分析能力，结果解释简单容易被临床医生理解，适合于临床应用。
除了上述靶分子外，HER2基因突变或扩增、BRAF突变、KRAS 突变、RET 基因重排、NTRK 家族基因重排等的检测方法可参照基因点突变、基因重排类型的检测方法和检测策略，更多的尚需临床实践的积累。
参考文献：
1. 中华医学会病理学分会, 国家病理质量控制与指导中心, 中华医学会肿瘤学分会肺癌学组,等. 非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南（2021版）. 中华病理学杂志, 2021, 50(4): 323-332.
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