——声明：仅供医疗专业人士参考
编者按：肺癌是当今世界严重危害人类健康的恶性肿瘤，分子生物学进展大大改变了晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗格局。肺癌的靶向治疗离不开肺癌的分子检测，分子检测标本及检测时机的选择，对后期检测结果的准确性有重要影响。为了规范肺癌的分子检测，阿斯利康公司（AZ）联合国内相关专家对肺癌分子检测的样本要求、检测平台、检测规范和检测观念进行全面阐述。本期91360智慧病理网邀请侯英勇教授就肺癌分子病理检测样本和时机的选择做高屋建瓴地概括和总结。
专家介绍
侯英勇
侯英勇
病理科科主任，病理基地主任，教授，主任医师
抗癌协会淋巴瘤委员会委员
卫生部临床病理质控中心分子病理工作组组员
中国临床肿瘤学会（CSCO胃肠间质瘤专家委员会，临床研究协作组）委员
《临床与实验病理学杂志》第六届编委
中国抗癌学会淋巴瘤专委会第一届病理学组组员
《BMC Cancer》杂志编委
《中华病理学杂志》专家
上海市抗癌协会淋巴瘤专业委员会委员
上海市医学会病理专科分会第九届委员会委员
中华医学会病理学分会消化系统疾病学组（筹）委员
主持国家自然科学基金青年基金、上海市浦江人才计划、上海市科委重点项目、上海市科委引导项目等多项课题。发表论文80余篇，其中第一作者和通讯作者SCI收录25篇。获科技成果1项，申请专利授权10项
参与制定“中国胃肠道间质瘤诊断治疗共识”，“中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家共识”，主编《胃肠道间质瘤》一书，副主编专著两部，参编两部，副主译一部
抗癌协会淋巴瘤委员会委员
卫生部临床病理质控中心分子病理工作组组员
中国临床肿瘤学会（CSCO胃肠间质瘤专家委员会，临床研究协作组）委员
《临床与实验病理学杂志》第六届编委
中国抗癌学会淋巴瘤专委会第一届病理学组组员
《BMC Cancer》杂志编委
《中华病理学杂志》专家
上海市抗癌协会淋巴瘤专业委员会委员
上海市医学会病理专科分会第九届委员会委员
中华医学会病理学分会消化系统疾病学组（筹）委员
主持国家自然科学基金青年基金、上海市浦江人才计划、上海市科委重点项目、上海市科委引导项目等多项课题。发表论文80余篇，其中第一作者和通讯作者SCI收录25篇。获科技成果1项，申请专利授权10项
参与制定“中国胃肠道间质瘤诊断治疗共识”，“中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家共识”，主编《胃肠道间质瘤》一书，副主编专著两部，参编两部，副主译一部
肺癌分子检测的标本及检测时机
非小细胞肺癌分子病理检测的适用人群指拟接受靶向治疗的肺浸润性腺癌 (或包括含腺癌成分的NSCLC) ，经活检组织病理学证实为非腺性的晚期NSCLC患者。临床工作中，不同标本的突变检出率不同。以EGFR基因变异为例，EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)单药治疗是EGFR基因突变局部晚期或转移NSCLC患者的标准治疗方案，但大多数患者会在用药后9—14个月发生耐药，其中EGFR基因第20号外显子发生错义突变(即T790M突变)是耐药突变中最主要的类型。目前已报道的EGFR-TKI耐药后组织样本的T790M突变阳性率基本在60％左右，不同技术方法检测结果较为相似，但是血浆样本T790M突变阳性率基于不同方法差别较大，在23％-63％[1-3]。部分需基因检测的NSCLC确诊时已是中晚期，部分患者往往由于肿瘤的位置或合并症的出现，难以通过干预措施获得其肿瘤组织。因此，仅有少数经手术的病例才可提供大标本，大部分病例则是通过各种小活检而完成诊断和分型的，其组织样本很小，且肿瘤细胞数量也较少。标本非常珍贵，需妥善处理，才能为必要的分子病理诊断提供保证。对于该类患者，也可采用胸水等细胞学标本；而对于晚期难以手术或靶向耐药的患者，则可选择血液检测[4]。
那么对于NSCLC分子检测标本类型有哪些呢？针对不同标本制定不同的检测方案才能对有限的标本做出精准的研判。
1.肿瘤组织石蜡标本
肿瘤组织仍然是目前耐药检测的首选样本，除了进行分子检测外，组织形态学的改变例如NSCLC向小细胞肺癌(SCLC)的转化，只能通过组织活检诊断。组织活检包括手术肿物大标本及活检组织。活检组织一般指来源于纤维支气管镜下活检、穿刺活检、EBUS、转移灶切取活检、骨转移活检等方法获取的标本。对于手术标本，优先选取肿瘤细胞比例较高的标本进行基因检测。若肿瘤细胞比例较低，可通过富集，以保证检测结果的准确可靠。组织学标本作为检测的“金标准”有标本可控，阳性率高、适用检测平台多等优点，这些都是细胞学及血液无法替代的，但同时其为侵入性检查，需要患者一般情况良好，可以耐受手术及穿刺活检；同时肿瘤手术及活检组织均具有异质性，部分组织检测可能无法反映肿瘤全貌。
肿瘤组织石蜡标本一般可提取组织的DNA或RNA进行检测。根据样本量的多少及检测目的选择合适的检测平台，如ARMS-PCR/NGS等即可满足组织的检测下限要求。ARMS的优点在于检测费用较低，且报告速度快，而NGS检测范围较为广泛，可以检测出更多位点的靶基因。根据患者初治或耐药选择相应的检测项目，如初诊患者优先检测EGFR、ALK、KRAS等指南共识推荐的常见驱动突变基因。一般推荐多基因检测，目前市场上基于此技术的多个商业化组织基因突变检测试剂盒已获NMPA的批准。
在某些特殊临床检测场景中，可推荐单基因检测：①对于部分晚期患者，标本量极少，不能满足联合检测的情况下；②组织标本质量欠佳，不能满足NGS等检测要求时，推荐单基因ARMS-PCR检测。
2.细胞学标本
在组织无法获取时，可考虑采用其他样本比如肿瘤细胞学样本进行检测(2A类)[5]。肿瘤细胞学标本是最接近肿瘤组织标本的样本，可收集其有形成分：包括胸水、细针穿刺、支气管刷检、肺泡灌洗液等，需制作成石蜡包埋标本，进行肿瘤细胞比例评估，满足检测要求后可进行检测。用胸腹水中的肿瘤细胞于基因检测时，必须确认肿瘤细胞，穿刺获得胸腹水样本提交给病理检查之后 ，根据目前样本检测情况，胸水的肿瘤细胞/基因含量显著高于血液，其检测下限要求也接近肿瘤组织。其优点在于适用于进展期肿瘤的患者，同时排除了组织学标本中肿瘤的异质性。在标本的提取中，离心后提取上层的cfDNA和下层RNA，可同时对DNA和RNA进行检测。2017年，美国病理学家协会(CAP)、国际肺癌研究协会(IASLC)、美国分子病理学会(AMP)联合更新的分子检测指南中推荐病理医师可以使用细胞团块或其他细胞学标本作为肺癌分子检测的合适标本[6]。一般推荐采用数字PCR、ARMS-PCR、NGS等方法进行检测。针对富集后细胞量较多的标本，应重视多基因联合检测对各自基因变异检测的局限性，必要时联合单基因检测技术。检测组织样本消耗较多，且成本较高，如果对所有必要的细胞进行检测及进行扩展靶点的全面检测，推荐高通量基因检测。
3.血液学/脑脊液标本
对于少数客观上不能获得组织或细胞学标本的晚期肺癌患者，推荐血液检测。一些晚期NSCLC患者的血液中存在循环游离肿瘤DNA（ctDNA），其血浆中ctDNA 会有一定的检出率。对于部分晚期发生脑膜转移的NSCLC 患者，脑脊液对颅内肿瘤的ctDNA具有富集作用，可通过腰椎穿刺获取脑脊液进行相关基因检测。但血液和脑脊液中的ctDNA含量很低，其基因检测具有较高的特异性，但灵敏性较差，因此对检测的方法学有较高的要求[7]。而这类检测样本往往具有局限性，例如患者在接受放化疗、炎症、抗血管治疗及免疫治疗等阶段由于正常细胞凋亡增加，导致ctDNA被稀释，影响血液检测结果，因此不推荐该阶段采样送检。多个国内外临床指南及《中国非小细胞肺癌患者EGFR T790M基因突变检测专家共识》[5]中指出一二代EGFR TKI患者血液T790M检测结果阴性时，可使用其他更灵敏的检测平台或组织标本进行复测。多个检测方法平行比较的研究均显示ddPCR法较普通ARMS方法更为敏感。NGS技术检测血液中T790M的阳性率在不同研究报道中有较大的差异(16.8％～54％)。在一定的测序覆盖深度下(有效深度超过1000倍，检测阈值达0.1％)NGS血液检测基于组织的敏感度为65％-71％。但由于不同实验室采用不同NGS平台、操作规程、测序深度以及生物信息学判读标准，可能导致不同检测敏感度，因此选择NGS进行T790M检测时应充分关注NGS技术参数。基于数字PCR和NGS的EGFR检测平台也在NMPA申报过程中，未来临床会有更多的选择[5] 。
当NSLC患者首次进行基因检测时，如果患者一般情况良好，优先推荐手术组织进行检测，可采用多基因联合检测或单点联检的方式，推荐ARMS-PCR/NGS检测平台。需要强调的是，当组织学结果阴性时需更换敏感性更高的平台进行复测。对于进展期患者，推荐胸水等细胞学标本，ddPCR、ARMS、NGS等平台；而对于无法耐受手术及穿刺或靶向用药三代耐药后的患者推荐血液检测，检测平台也推荐敏感性更高的ddPCR及NGS进行检测。
参考文献
[1]Wang W，Song Z，Zhang Y．A Comparison of ddPCR and ARMS for detecting EGFR‘1790M status in ctDNA from advanced NSCLC patients with acquired EGFR．TKI resistance『J I．Cancer Med，2017，6(1)：154．162．
[2] Oya Y，Yoshida T，Kuroda H，et a1．Association Between EGFR 71790M Status and Progression Patterns During Initial EGFR—TKI Treatment in Patients Harboring EGFR Mutation J 1．Clin Lung Cancer，2017，18(6)：698-705．DOI：10．1016／j．cllc．2017．05．004．
[3] Kawamura T．Kenmotsu H，Omori S，et a1．Clinical Factors Predicting Detection of T790M Mutation in Rebiopsy for EGFR—Mutant Non—small—cell Lung Cancer[J]．Clin Lung Cancer，2018，19(2)：e247一e252．
[4] 王恩华 朱明华 步宏,等.《非小细胞肺癌靶向药物治疗相关基因检测的规范建议》，中华病理学杂志，2016，45（2）：73-77
[5] 中国临床肿瘤学会肿瘤生物标志物专家委员,《中国非小细胞肺癌患者EGFR T790M基因突变检测专家共识》，中华医学杂志，2018，98（32）：2544-2551
[6] Lindeman NI，cagle Prr，Aisner DL，et a1． Updated mo1ecular Testing Guideline for the Selection of Lung Cancer Patients for Treatment With Ta。geted Tymsine Kinase Inhibitors：Guideline From the ColIege of American Pathology，the Intemational Association for the Study of Lung Cancer，and the Association for Molecular Pathology[J]．Arch Pathol Lab Med，2018，142(3)：32l-346．
[7]应建明，梁智勇 等，《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南》，中华病理学杂志，2021，50（4）：323-332
那么对于NSCLC分子检测标本类型有哪些呢？针对不同标本制定不同的检测方案才能对有限的标本做出精准的研判。
1.肿瘤组织石蜡标本
肿瘤组织仍然是目前耐药检测的首选样本，除了进行分子检测外，组织形态学的改变例如NSCLC向小细胞肺癌(SCLC)的转化，只能通过组织活检诊断。组织活检包括手术肿物大标本及活检组织。活检组织一般指来源于纤维支气管镜下活检、穿刺活检、EBUS、转移灶切取活检、骨转移活检等方法获取的标本。对于手术标本，优先选取肿瘤细胞比例较高的标本进行基因检测。若肿瘤细胞比例较低，可通过富集，以保证检测结果的准确可靠。组织学标本作为检测的“金标准”有标本可控，阳性率高、适用检测平台多等优点，这些都是细胞学及血液无法替代的，但同时其为侵入性检查，需要患者一般情况良好，可以耐受手术及穿刺活检；同时肿瘤手术及活检组织均具有异质性，部分组织检测可能无法反映肿瘤全貌。
肿瘤组织石蜡标本一般可提取组织的DNA或RNA进行检测。根据样本量的多少及检测目的选择合适的检测平台，如ARMS-PCR/NGS等即可满足组织的检测下限要求。ARMS的优点在于检测费用较低，且报告速度快，而NGS检测范围较为广泛，可以检测出更多位点的靶基因。根据患者初治或耐药选择相应的检测项目，如初诊患者优先检测EGFR、ALK、KRAS等指南共识推荐的常见驱动突变基因。一般推荐多基因检测，目前市场上基于此技术的多个商业化组织基因突变检测试剂盒已获NMPA的批准。
在某些特殊临床检测场景中，可推荐单基因检测：①对于部分晚期患者，标本量极少，不能满足联合检测的情况下；②组织标本质量欠佳，不能满足NGS等检测要求时，推荐单基因ARMS-PCR检测。
2.细胞学标本
在组织无法获取时，可考虑采用其他样本比如肿瘤细胞学样本进行检测(2A类)[5]。肿瘤细胞学标本是最接近肿瘤组织标本的样本，可收集其有形成分：包括胸水、细针穿刺、支气管刷检、肺泡灌洗液等，需制作成石蜡包埋标本，进行肿瘤细胞比例评估，满足检测要求后可进行检测。用胸腹水中的肿瘤细胞于基因检测时，必须确认肿瘤细胞，穿刺获得胸腹水样本提交给病理检查之后 ，根据目前样本检测情况，胸水的肿瘤细胞/基因含量显著高于血液，其检测下限要求也接近肿瘤组织。其优点在于适用于进展期肿瘤的患者，同时排除了组织学标本中肿瘤的异质性。在标本的提取中，离心后提取上层的cfDNA和下层RNA，可同时对DNA和RNA进行检测。2017年，美国病理学家协会(CAP)、国际肺癌研究协会(IASLC)、美国分子病理学会(AMP)联合更新的分子检测指南中推荐病理医师可以使用细胞团块或其他细胞学标本作为肺癌分子检测的合适标本[6]。一般推荐采用数字PCR、ARMS-PCR、NGS等方法进行检测。针对富集后细胞量较多的标本，应重视多基因联合检测对各自基因变异检测的局限性，必要时联合单基因检测技术。检测组织样本消耗较多，且成本较高，如果对所有必要的细胞进行检测及进行扩展靶点的全面检测，推荐高通量基因检测。
3.血液学/脑脊液标本
对于少数客观上不能获得组织或细胞学标本的晚期肺癌患者，推荐血液检测。一些晚期NSCLC患者的血液中存在循环游离肿瘤DNA（ctDNA），其血浆中ctDNA 会有一定的检出率。对于部分晚期发生脑膜转移的NSCLC 患者，脑脊液对颅内肿瘤的ctDNA具有富集作用，可通过腰椎穿刺获取脑脊液进行相关基因检测。但血液和脑脊液中的ctDNA含量很低，其基因检测具有较高的特异性，但灵敏性较差，因此对检测的方法学有较高的要求[7]。而这类检测样本往往具有局限性，例如患者在接受放化疗、炎症、抗血管治疗及免疫治疗等阶段由于正常细胞凋亡增加，导致ctDNA被稀释，影响血液检测结果，因此不推荐该阶段采样送检。多个国内外临床指南及《中国非小细胞肺癌患者EGFR T790M基因突变检测专家共识》[5]中指出一二代EGFR TKI患者血液T790M检测结果阴性时，可使用其他更灵敏的检测平台或组织标本进行复测。多个检测方法平行比较的研究均显示ddPCR法较普通ARMS方法更为敏感。NGS技术检测血液中T790M的阳性率在不同研究报道中有较大的差异(16.8％～54％)。在一定的测序覆盖深度下(有效深度超过1000倍，检测阈值达0.1％)NGS血液检测基于组织的敏感度为65％-71％。但由于不同实验室采用不同NGS平台、操作规程、测序深度以及生物信息学判读标准，可能导致不同检测敏感度，因此选择NGS进行T790M检测时应充分关注NGS技术参数。基于数字PCR和NGS的EGFR检测平台也在NMPA申报过程中，未来临床会有更多的选择[5] 。
当NSLC患者首次进行基因检测时，如果患者一般情况良好，优先推荐手术组织进行检测，可采用多基因联合检测或单点联检的方式，推荐ARMS-PCR/NGS检测平台。需要强调的是，当组织学结果阴性时需更换敏感性更高的平台进行复测。对于进展期患者，推荐胸水等细胞学标本，ddPCR、ARMS、NGS等平台；而对于无法耐受手术及穿刺或靶向用药三代耐药后的患者推荐血液检测，检测平台也推荐敏感性更高的ddPCR及NGS进行检测。
参考文献
[1]Wang W，Song Z，Zhang Y．A Comparison of ddPCR and ARMS for detecting EGFR‘1790M status in ctDNA from advanced NSCLC patients with acquired EGFR．TKI resistance『J I．Cancer Med，2017，6(1)：154．162．
[2] Oya Y，Yoshida T，Kuroda H，et a1．Association Between EGFR 71790M Status and Progression Patterns During Initial EGFR—TKI Treatment in Patients Harboring EGFR Mutation J 1．Clin Lung Cancer，2017，18(6)：698-705．DOI：10．1016／j．cllc．2017．05．004．
[3] Kawamura T．Kenmotsu H，Omori S，et a1．Clinical Factors Predicting Detection of T790M Mutation in Rebiopsy for EGFR—Mutant Non—small—cell Lung Cancer[J]．Clin Lung Cancer，2018，19(2)：e247一e252．
[4] 王恩华 朱明华 步宏,等.《非小细胞肺癌靶向药物治疗相关基因检测的规范建议》，中华病理学杂志，2016，45（2）：73-77
[5] 中国临床肿瘤学会肿瘤生物标志物专家委员,《中国非小细胞肺癌患者EGFR T790M基因突变检测专家共识》，中华医学杂志，2018，98（32）：2544-2551
[6] Lindeman NI，cagle Prr，Aisner DL，et a1． Updated mo1ecular Testing Guideline for the Selection of Lung Cancer Patients for Treatment With Ta。geted Tymsine Kinase Inhibitors：Guideline From the ColIege of American Pathology，the Intemational Association for the Study of Lung Cancer，and the Association for Molecular Pathology[J]．Arch Pathol Lab Med，2018，142(3)：32l-346．
[7]应建明，梁智勇 等，《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南》，中华病理学杂志，2021，50（4）：323-332
声明：
仅供医疗专业人士参考；
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仅供医疗专业人士参考；
本文的采访/撰稿/发布由阿斯利康提供支持
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