陈国荣教授、主任医师、硕士生导师

温州医科大学形态学系主任兼温州医科大学附属第一医院病理科主任

中华医学会病理学分会中青年委员

中国医师协会病理科医师分会会员

浙江省病理学会副主任委员

浙江省抗癌协会肿瘤病理专业委员会副主任委员

浙江省医学会精准医学分会委员

浙江省医师协会病理科医师分会副会长

浙江省温州市病理学会主任委员

浙江省温州市临床病理质控中心主任

浙江省温州市医学会肿瘤学分会委员

PD-L1检测影响因素

　　陈国荣教授：PD-L1检测目前采用的是免疫组化技术。免疫组化就是应用抗原抗体反应的基本原理，通过标记的抗体来检测某组织中的特定抗原，最终根据特定的显色，确定某组织是否存在待测抗原的一种方法。免疫组化是一个多步骤、多条件的复杂过程，每一步骤都会影响最终的结果，但影响较大的因素主要为抗原修复和抗体质量。

　　免疫组化第一步是使用10%的中性福尔马林固定待处理组织。组织里包含大量的蛋白质，其中的氨基酸残基和甲醛结合形成醛键，而使抗原的抗原性被掩盖。这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好地反应，所以需要经过抗原修复处理来揭示表位。将被掩盖的抗原暴露出来的过程称为“抗原修复”。抗原修复包括物理方法和化学方法两种，物理方法一般为加热（热诱导表位修复， HIER），可以用微波炉等；化学方法一般用蛋白水解酶进行酶促降解（蛋白水解诱导的表位修复， PIER）。不正确的生物标志物抗原修复将对染色结果产生不利影响。对于检测平台，使用检测系统放大和可视化抗原/抗体复合物信号，反应的放大强度会影响染色结果。

　　抗体的特异性和敏感性也将影响染色结果，目前上市的PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂均对应不同抗体克隆号，在不同检测平台上使用。2015年10月美国FDA批准PD-L1 IHC 22C3 pharmDx检测法作为晚期NSCLC患者使用帕博利珠单抗治疗的伴随诊断。伴随诊断是通过体外检验设备提供一定的疾病信息来帮助提高相对应药物在使用过程中的安全性和有效性的手段。可将患者分为生物标志物阳性和生物标志物阴性两个亚群，在许多肿瘤的治疗决策中起到核心指导作用。与补充诊断相比，伴随诊断对治疗具有明确的指导意义，监管更严格，有助于筛查出最佳用药人群，患者获益更大。

　　陈国荣教授：PD-1/PD-L1抑制剂使用基于指定抗体克隆号和特定自动化染色检测平台。目前，因国内医院平台的多样性，Dako ASL48可及性整体并不高，这种情况下，22C3用于Ventana平台、Leica或手工操作等实验室自行开发的检测方法，在做好LDT条件优化和质量控制前提下，也可作为次选。要做好LDT的质量控制，主要包括室内质量控制和室间质量控制。

　　室内质量控制主要针对制作标本的流程，包括试剂质控、组织处理质控、切片质控、切片脱蜡质控、抗原修复和对照设置等。设置对照是其中重要方面之一，包括阳性对照和阴性对照。阳性对照主要反映抗体的敏感性，不仅可以用于证实目的抗原是否存在，还可对抗原表达水平的高低进行评估，若阳性对照无阳性染色，则同批次的检测样本染色结果无效。PD-L1检测建议采用扁桃体组织作为阳性对照组织，显示隐窝上皮细胞的强染色和生发中心滤泡巨噬细胞的弱到中等染色。内皮细胞、成纤维细胞以及表面上皮细胞应该是阴性的。

　　阴性对照主要反映抗体的特异性，包括特异性阴性对照和非特异性阴性对照两类。阴性试剂对照是指使用其他试剂代替一抗，用来评估检测样本是否有非特异性染色，用以证实特异的抗原位点染色。理想的替代试剂含有除特异性一抗以外的所有成分，且与一抗生产过程相同，与人体组织不产生特异性反应。若出现阴性对照着色，说明待检测组织样本中存在非特异性染色，所以只有阳性对照呈现阳性，阴性对照呈现阴性，才能确保检测结果的正确性。阴性试剂对照实验除了特异性一抗以外的所有过程与检测系统一致。

　　因为整个技术和操作流程可能存在一些系统性误差，所以实验室相互之间要实行标准化，进行统一的规范化管理，进行室间质量控制。目前国内外相关的实验室质量评估包括：北欧的Nordi QC、美国的CAP、英国的UKNEQAS、我国的PQCC/CCP以及各地病理质量控制中心组织的相关的室间质量评估等，下级省/市也有相应的质量控制中心来进行质量控制方面的监督和检查。换言之，一个实验室现阶段的操作流程，也要进行室间质量评估来进行校正。

　　陈国荣教授：PD-L1免疫组化判读需要病理医生在显微镜下观察染色情况得出结果，具有一定的主观性，所以判读医生是否接受过系统专业的培训尤为重要，同时检测报告也要实行标准化。目前TPS被用于NSCLC的判读打分（TPS: 任何强度的呈现完整或部分膜染色可视肿瘤细胞相对于所有未坏死的肿瘤细胞的比例）。

　　判读注意事项主要有三个方面：第一，要保证有足够多、活的肿瘤细胞用于判断,合格的标本至少要有100个可视的肿瘤细胞。第二，抗原的定位，表达于肿瘤细胞上PD-L1膜染色才被纳入计算TPS，包括所有强度为1~3+膜染色的肿瘤细胞、部分和完整的细胞膜、所有可视的和明确的膜染色。第三，染色的免疫细胞、坏死细胞和细胞质染色的细胞不参与评分。

　　经大量临床试验的验证，最终提出22C3的判读范围以1%和50%作为cut-off值。呈现部分或完整细胞膜染色的肿瘤细胞占活肿瘤细胞<1％定义为阴性；呈现部分或完整细胞膜染色的肿瘤细胞占活肿瘤细胞1%～49％定义为低表达；呈现部分或完整细胞膜染色的肿瘤细胞占活肿瘤细胞≥50％定义为高表达。根据PD-L1的表达程度来决定患者的治疗策略，如初治的非小细胞肺癌患者（NSCLC）PD-L1 TPS≥50%，可以建议患者进行帕博利珠单抗单药治疗；对于经治NSCLC患者，若TPS≥1%就可以推荐患者行帕博利珠单抗治疗。