图1.肺癌小标本检测规范化流程^【3】

　　组织活检小标本的取材方式一般为：1.外科手术:纵隔镜检查，淋巴结或浅表肿物切除。胸腔镜活检或切除，开胸活检等；2.活检：经支气管镜活检，经皮肺穿刺活检，转移部位穿刺活检，胸膜活检等。其中应用最广泛的是经支气管镜活检和经皮穿刺活检；3.细胞学：TBNA或EBUS-TBNA，经支气管刷检，支气管肺泡灌洗液，体腔积液细胞学等。这些方法中，可获取的组织或细胞数目依次减少，因此需选取合适的方法对可疑病灶进行取材。不同组织活检小标本取材方式不同并有其优缺点：1.手术标本：可获得充分的组织，诊断准确，可同时切除原发灶，但同时创伤大，需肺叶切除，损失肺功能；2.经皮肺穿刺活检术：适用于外周型肿物，创伤较小，但穿刺时受呼吸影响，容易咯血，取得的组织较少；3.纤维支气管镜检查：适用于段支气管及中央型病变的观察与活检，创伤小，但取得的组织少，未侵入气道内的肿物难以取到，活检后常见出血；4.骨转移灶取样：创伤小，可取出转移灶碎片，可明确病理组织类型，但标本较少，需经脱钙液处理，难以做基因检测。目前，CSCO指南中组织活检在临床取材中的基本原则为：多学科联合的方式，以最小的创伤，取足量的组织。基本策略推荐纤维支气管镜，经皮肺穿刺活检，淋巴结活检及体腔积液细胞学检查等。可选策略推荐胸腔镜、纵隔镜和EBUS。

　　组织活检小标本在处理过程中有很多需要注意的地方。一般福尔马林固定时间越长，发生交联的程度越高；适当的固定，保留组织形态，可以精准定位肿瘤细胞。当组织样本不做固定时，其纯化产物易于蛋白降解，形态发生破坏，但核酸片段完整，纯化后效果较好，这类组织不适合做免疫组化标记和FISH等。适度的福尔马林固定后的标本，蛋白保留，形态保留，一部分核酸被片段化，一部分核酸与蛋白质发生交联，对分子诊断会产生一定影响，对一般的免疫组化检测影响不大。而长时间经福尔马林固定后的标本，核酸被严重片段化，核酸与蛋白质发生大量交联，严重影响免疫组化、FISH、PCR和NGS等分子实验的结果。组织活检小标本固定的基本要求：1. 选择合适的固定液：组织学标本需10%中性缓冲福尔马林（即4%甲醛磷酸盐缓冲液pH 7.2-7.4）。使用乙醇固定液 、非中性、浓度不足的福尔马林固定液都将影响固定后的组织结构不当的固定会破坏细胞形态，降低染色质量，严重的延迟固定甚至造成组织自溶 。须确认10%中性缓冲福尔马林溶液为即用型，非浓缩型，须确认10%中性缓冲福尔马林溶液在效期内。定期更换、室温贮存。过期、浓度不当的固定液，可能导致IHC/ISH 片状、不正常染色。细胞学标本需采用95%乙醇、50%乙醇及液基专用固定液。2.足量的固定液。组织学标本固定液体积比为1:10以上, 不可低于1:4。固定不足会导致后续酒精固定、染色不稳定，及时固定组织离体后立即置入固定液中, 越快越好，最好在20min内固定,建议不超过一小时。充分固定，固定时间建议6-72小时，24小时为最佳。活检的小标本至少需要6-8h的10%中性福尔马林固定。

　　对于后续需进行不同检测的标本其要求不同。1.IHC、FISH石蜡样本制备要求：组织固定需10%中性缓冲福尔马林，组织离体后立即固定（1h内），固定液量与所浸泡组织比例足够，固定6-72小时为宜。对于组织切片，未经染色切片室温放置不宜超过6周。IHC检测切片厚度3-5μm为宜。FISH检测切片厚度4-5μm为宜。2. ARMS-PCR样本制备要求：组织固定需10%中性缓冲福尔马林，组织离体后立即固定（30min内），固定液量≥10倍固定标本体积，活检组织标本固定6-12小时，手术切除标本固定6-48小时。保证包含足够的肿瘤细胞，尽量剔除非肿瘤组织和细胞。组织切片推荐肿瘤细胞数量在200个以上，肿瘤细胞比例达50%。一般需切厚度5-10μm的切片，10张以满足对肿瘤细胞数量的要求。切片时要有措施避免不同病例组织间的交叉感染。3.NGS（靶向测序）检测样本“质”要求：组织固定需10%中性缓冲福尔马林。活检标本固定24小时，对于穿刺样本，固定时间控制在6-24小时为佳。长时间（1周以上）浸泡在福尔马林中的样本DNA会被片段化，不能检出突变。组织切片切取5张连续切片，其中1片进行HE染色，确认肿瘤细胞的含量。肿瘤细胞是否存在，是开展肿瘤个体化治疗基因检测的重要前提。4. NGS（靶向测序）检测样本“量”要求：组织块要求不小于5×5×5mm，组织包于蜡块正中央，提供至少5-8张面积约25mm2厚度3-10μm的肿瘤组织切片， 每张切片肿瘤组织的含量至少在70% 以上。过低的肿瘤组织含量，会直接影响肿瘤突变丰度，造成假阴性。穿刺石蜡标本可进行NGS检测，目前有些技术2张石蜡切片（最低2ng DNA）即可满足检测需要，检测前应由病理医生根据肿瘤占比评估能否适用于检测。

　　组织活检小标本的分子检测平台的选择：常规分子病理诊断技术仍然是目前主流，NGS等高通量高敏感技术已走向前台。可选择的平台有：1.免疫化学（IHC）检测；2. 荧光原位杂交（FISH）检测；3. ARMS-PCR检测；4. 核酸序列测定：包括Sanger测序、焦磷酸测序和NGS测序。NGS是目前“热门”的分子病理检测技术，它可以边合成、边测序，多位点、多基因同时检测。同时还可以对肿瘤进行用药指导，既可以定性检测也可以定量检测。在小组织标本样本量充足的情况下，可应按指南进行相应的分子检测。现阶段单基因检测地位不可取代，PD-L1 IHC检测目前面临诸多挑战，国内缺乏检测标准。EGRR、KRAS、BRAF和HER2等基因突变推荐单基因检测和NGS全外显子组测序；FGFR2和MET的基因扩增优先推荐FISH检测；ALK,ROS1和RET的基因重排推荐FISH和RT-PCR检测；EGFR、MET、PD-1/PD-L1蛋白过表达优先推荐IHC和ELISA检测。而对于PD-L1表达的免疫组化检测结果，目前上市的5种药物都有其不同的评分标准和FDA推荐的诊断状态，国内目前普遍采用的是针对Pembrolizumab的22C3抗体，通常作为伴随诊断需计数肿瘤细胞的TPS，临床中报告的截断值以1%和50%为界。

　　目前组织活检小标本检测流程的需要进一步优化。如何让有限的样本量既满足诊断与鉴别诊断又要同时完成IHC、FISH、PCR及NGS检测等全方位的病理学评价亟需规范化的管理。原则是尽可能少的使用免疫组化指标，以节省标本用于分子检测。60-70%的NSCLC分化较好，可以通过形态学确诊。30%分化较差的，可使用IHC(TTF-1和p40)辅助诊断。一次性切出病理诊断和分子检测需要的样本量，避免重复切片浪费标本。推荐使用表1中的免疫标记进行鉴别^【4】:

表1.NSCC鉴别诊断推荐免疫标记物