编者按：晚期非小细胞肺癌大多采用穿刺活检标本进行病理学诊断和基因检测，由于活检标本中肿瘤组织含量少，因此，采用最佳的检测方法对患者的治疗非常重要。本文针对非小细胞肺癌穿刺活检标本进行基因检测应该采用的标准流程进行了比较详细的介绍，也阐述了不同样本应采取的适应检测方法。

　　肺癌是目前世界范围内死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占其总数的85%。对于一些影像学高度怀疑癌的结节，在CT引导下通过不同方式取材活检行病理学检查，对肺内结节的明确诊断及后续治疗起到了重要的作用，其准确性高，可操作性强。而在实际工作中，由于患者穿刺组织少，极易造成漏诊和误诊，特别是经过常规制片HE染色，免疫组织化学检查等鉴别诊断后，剩余组织较少，很难再进行进一步分子病理检测，严重影响患者的治疗。因此非小细胞肺癌穿刺活检标本需要严格且规范的基因检测流程。

　　十年前，晚期NSCLC的治疗相对统一，全身化疗效果有限。现如今，肿瘤基因组学和/或免疫生物标志物检测在晚期NSCLC（尤其是腺癌）的初始评估和治疗中必不可少。全球范围内已获批与治疗相关的生物标志物列表包括：表皮生长因子受体（EGFR）基因突变、间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶（ALK）基因重排、ROS原癌基因1受体酪氨酸激酶（ROS1）基因重排、B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶（BRAF）V600E基因突变、程序性死亡配体1（PD-L1）的表达。此外，罕见基因的驱动位点近些年来有了新的突破，如：MET原癌基因受体酪氨酸激酶（MET）基因突变或扩增，HER2受体酪氨酸激酶2（ERBB2）基因突变和扩增、Ret原癌基因（Ret）基因重排和神经营养受体酪氨酸激酶（NTRK）基因重排等。然而，肺癌中最常见的基因组事件-肿瘤蛋白P53（TP53）和KRAS原癌基因GTPase（KRAS）基因突变仍是难以确定的药物靶点。

　　穿刺组织进行这些分子检测时，首先样本采集及处理是确保后续基因检测的关键和基础。样本的先期处理更是所有后续检测的根本保证，不同样本如果采集处理不规范则会导致检测结果不准确，易出现假阴性或者假阳性，对患者用药造成很大影响。在样本处理的中心环节，DNA提取之前的病理质量控制非常重要，它决定了最终检测结果的可靠性。而RNA提取常比较困难，尤其是保存年限较长的肿瘤组织，RNA降解非常严重。因此从样本的储存、RNA的提取及保存，都需要格外小心，防范RNase对RNA的降解作用。同时，还要注意采集时防止污染，对检测样本造成不必要的干扰。以EGFR检测为例，它不仅能够预测小分子EGFR TKI的疗效，是TKI疗效重要的预测因子，标本污染或处理不当导致DNA过度降解可能导致EGFR检测假阳性或假阴性，进而延误患者的治疗。组织活检小标本的分子检测平台的选择：常规分子病理诊断技术仍然是目前主流，NGS等高通量高敏感技术已走向前台。可选择的平台有：1.免疫化学（IHC）检测；2. 荧光原位杂交（FISH）检测；3. ARMS-PCR检测；4. 核酸序列测定：包括Sanger测序、焦磷酸测序和NGS测序。NGS是目前“热门”的分子病理检测技术，它可以边合成、边测序，多位点、多基因同时检测。同时还可以对肿瘤进行用药指导，既可以定性检测也可以定量检测。在小组织标本样本量充足的情况下，可应按指南进行相应的分子检测。现阶段单基因检测地位不可取代，PD-L1 IHC检测目前面临诸多挑战，国内缺乏检测标准。EGRR、KRAS、BRAF和HER2等基因突变推荐单基因检测和NGS全外显子组测序；FGFR2和MET的基因扩增优先推荐FISH检测；ALK，ROS1和RET的基因重排推荐FISH和RT-PCR检测；EGFR、MET、PD-1/PD-L1蛋白过表达优先推荐IHC和ELISA检测。而对于PD-L1表达的免疫组化检测结果，目前上市的5种药物都有其不同的评分标准和FDA推荐的诊断状态，国内目前普遍采用的是针对Pembrolizumab的22C3抗体，通常作为伴随诊断需计数肿瘤细胞的TPS，临床中报告的截断值以1%和50%为界。

　　对于活检穿刺标本的预处理也至关重要：肿瘤新鲜冷冻材料可提取出最高品质的DNA、RNA。在手术现场取样时需要在显微镜下确认肿瘤细胞含量。必要时应采取富集肿瘤细胞的方法，如手工刮取或显微切割法。选取以肿瘤细胞为主的、没有明显的坏死、黏液和炎性改变的组织进行检测^[1]。周围炎症严重的肿瘤、黏液产生过高的肿瘤、病变中心广泛纤维化的肿瘤细胞不能采集，以免产生假阴性结果。切割后取其中一半，并利用另一半切面制作组织标本，然后进行确认。由于组织样本通常需先进行病理学分析，在分析完成后应尽早将组织样本置于稳定剂中，避免核酸降解^[1-2]。对于需要转送至院外的样本，建议离体30分钟后应先转入中性福尔马林或组织保存液中，低温运输至院外实验室进行实验操作。对于RNA检测的样本，如果未经稳定化处理则必须速冻后，放在干冰中运送。经过适当稳定化处理的样本，可在常温下运送。

　　在检测肿瘤基因突变时，不能一味追求检测方法的灵敏度，灵敏度高的检测方法对整个实验过程中的质控要求更为严格，需防止因污染而产生假阳性。在肿瘤靶基因表达检测时，由于肿瘤样本的不可再生性，需谨慎选择使用的方法，如选用荧光定量PCR要求提取的总RNA量达1µg以上，如果肿瘤组织过小，提取的RNA量可能达不到检测要求，此时应考虑选用对样本量要求低的检测方法。DNA提取之前的病理质量控制非常重要，它决定了最终检测结果的可靠性。

[1]Collection, Transport, Preparation, and Storage of Specimens for Molecular Methods; Approved GuidelineMM13-A

[2]詹启敏，曾益新，王钰等，《肿瘤个体化治疗检测技术指南》（试行）