病理缓解评估在肺癌新辅助治疗的应用及实践

编者按

近些年来，新辅助治疗也开始应用于肺癌中，也取得了良好的结果。但随之而来的问题是病理医生应该如何评估经过新辅助治疗后肺癌手术切除标本。为了让广大病理医生熟悉新辅助治疗后肺癌手术切除标本的病理评估，91360首先特别邀请复旦大学附属肿瘤医院病理科李媛教授介绍肺癌新辅助治疗后手术切除标本IASLC多学科建议，并详细介绍了新辅助治疗后PCR和MRP两个主要指标，并对其进行了详细的解读。然后邀请复旦大学附属肿瘤医院病理科郑强教授就新辅助治疗术后标本的规范化取材、病理学评估以及病理报告，并结合本院实际病例进行了详细讲解。

李媛教授：

今天我在这里要跟大家共同分享一下关于病理缓解程度的评估在肺癌新辅助治疗中的应用和实践。目前有很多研究已经表明，肺癌新辅助治疗以后病理缓解程度与新辅助治疗的疗效以及患者的预后有显著的相关性。对于新辅助治疗以后术后标本的一个规范化的评估显得格外的重要。今天我在这里将和我的同事郑强医生就新辅助治疗后术后标本的一个病理缓解的评估跟大家进行一个共同的分享。

下面就是我们要讲的主要内容。首先由我来介绍下对于病理评估的指南以及一些方法。实际上早在2012年在JTO上就有关新辅助化疗以后病理缓解程度的一个评估。从这个评估的方法来上看，对于瘤床每隔0.5~1cm进行一个剖面，每个剖面进行相应的一个制片，对每一张切片需要进行评估活性肿瘤细胞所占的一个百分比。我们可以看到对从a一直到j的切片上依次的进行评估，最后把所有评估的一个数值相加再除以10个这个切片的一个数，最后得出来的就是残存肿瘤细胞所占的一个比例。

随着免疫治疗、新辅助免疫治疗的一个应用，在2018年提出了对于切除的非小细胞肺癌新辅助免疫治疗的一个病理评估相关的一个建议。在2020年针对泛肿瘤免疫治疗的病理评估也提出了一个相关的病理学评价的一个方法。我们国家国内也有相关的对于新辅助免疫治疗以后手术标本的一个评估相关的一些形态学一个标准。特别值得一提的是2020年由国际肺癌协会提出的一个针对非小细胞肺癌新辅助治疗以后切除标本的一个病理评估一个多学科的建议，这个多学科建议中间，它规范化的对于肺癌术后的标本前处理以及标本的取材以及对于病理评估的要素以及最后这个病理报告都进行了一个相关的一个规定。我们国家也由国家质控中心提出的一个非小细胞肺癌新辅助治疗病理评估的一个专家共识，实际上也是结合国际肺癌协会的多学科的建议，也是采纳了相关的一些病理的评估标准。特别值得一提的是，它明确了对于两个评价指标MPR以及PCR的一个定义以及评价方法。下面我们就来看一下国际肺癌协会提出的这个新辅助治疗一个评估的一个方法。我们知道新辅助治疗有新辅助化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗及一系列的联合治疗。对于这个新辅助治疗疗效的一个病理评估的方法实际上适合所有的新辅助疗法，并且适用于所有组织学类型。对于不同的组织学类型的新辅助治疗以及不同的疗法，目前公认的一个评价指标包括两个：第一个叫做CPR，也叫做完全病理缓解，其实就是我们习惯称之为的pCR，它指的是对于整体疗效的评价，那不仅仅是要评价完整切除的肺癌标本，同时也要评价所取样的一个区域性淋巴结。对于原发灶和淋巴结均未发现存活的肿瘤细胞，这个时候我们可以说它达到了一个完全病理学的缓解，称之为CPR或者pCR。除了CPR这个评价指标以外，那我们还需要关注的另外一个评价指标，就叫做MPR，中文也叫做主要病理缓解。对于MPR定义我们可以看到在国际肺癌多学科的建议中，它主要针对的是原发灶的疗效评估，指的是原发灶中存活肿瘤细胞占肿瘤床面积≤10%称之为MPR。实际上对于不同的临床研究可能采用的评价标准略有不同。特别值得一提的是目前国内外首个获批的新辅助免疫联合治疗的研究CheckMate816研究中间的MPR，不仅仅是对原发灶的一个疗效评估，同时也是对淋巴结的疗效进行了评估。它≤10%才能满足MPR的标准。下面我们就来具体看一下国际肺癌协会多学科的建议中对于肿瘤疗效评估的一些具体的评价方法。首先我们拿到一个术后标本，需要明确肿瘤床的位置，除此之外我们需要把肿瘤床里面的主要成分分为三个部分：第一个就是存活的肿瘤细胞，第二部分就是一个坏死组织，第三个部分就是一个间质，间质包括了一些炎症反应，同时也包括了一些纤维化的间质。我们对于肿瘤床进行了充分的取材以后，我们需要评估肿瘤床中所有的HE的切片，通过计算每张切片中存活肿瘤细胞、坏死以及间质的一个百分比来评价整个瘤床的对于新辅助治疗的一个疗效。下面我们来看一下B图，在B图的第一张图中我们可以看到坏死的区域大概是40%，除此之外活的肿瘤细胞所占的面积大概是50%，残存的活性肿瘤细胞占到这张切片的一个比例大概就是一个50%。当然我们对于瘤床的评估需要充分的取材，并且要进行一个加权一个平均，最后得出来的值就是这个患者残存肿瘤细胞的一个比值。如果没有肿瘤细胞残留，我们就说它达到了一个CPR，或者是肿瘤细胞残留的比例≤10%，那么就说它达到了一个MPR。下面从这张图表上我们可以看到对于肺癌的一个新辅助治疗的评估，从最早2012年提出来的对于肺癌新辅助化疗术后标本的评估，2018年提出来的对于肺癌新辅助免疫治疗的一个病理缓解程度的评估，以及2020年由国际肺癌协会多学科建议提出的对于所有新辅助治疗疗效的肺癌提出一个这个病理缓解程度的一个评估。我们可以看到对于每一种评价方法都针对了瘤床的取材以及对于瘤床的组织学特征以及计算方法提出了一些评价的标准。除此之外我们可以看到每一种评价的方法最后所定义的评价指标主要是两个评价指标，一个是MPR一个就是CPR，也就是这两个评价学指标残存的肿瘤细胞≤10%或者是无残存的活性肿瘤细胞作为我们的评价指标。关于瘤床是如何进行取材以及新辅助治疗以后瘤床的一个组织学的改变，以及对于我们瘤床的残存肿瘤细胞的比例的计算，后续我们郑强医生会跟大家做出一个详细的评估。这里我重点想跟大家提一下我们进行一个半定量的评估，实际上是对所有切片的结果进行一个加权的一个平均来计算整个病例的病理缓解程度。在我们评估中需要和我们肉眼的结果进行一个比对，最终得出来的这个值才能代表这个肿瘤病理缓解的程度。我们简单的举一个例子，我们可以看到在A号切片瘤床所占的面积大概是B号切片瘤床的面积的一半，如果我们只是简单的进行一个平均，这个时候它的肿瘤细胞残存的比例就会发生一些偏差，因此我们需要做一个加权的平均。我们来举几个简单的例子，首先我们来看左边这幅图它有两张切片，显然第二张切片它所占的面积也就是瘤床的一个范围，大概是第一张切片的一个四分之一，如果我们进行一个简单的平均，我们可以看到在第一张切片中间活性肿瘤细胞残存比例是0%，第二张切片活性肿瘤细胞残存比例是25%，如果是一个简单的一个平均的话，我们得出来这个病例活性肿瘤细胞残存比例12.5%，这个实际上是并没有达到我们MPR≤10%的一个指标。但是如果我们仔细去观察，我们就会发现实际上我们并没有考虑到每张切片中瘤床面积的一个差异，实际上对于这一个病例而言残存的活性肿瘤细胞占到1号和2号切片的总的比例实际上只能占到5%。也就是对于这种切片中瘤床面积差异大的时候，我们需要进行一个加权平均，经过加权平均以后我们可以看到这个病例实际上残存的肿瘤细胞的比例是5%，已经达到了MPR的一个标准。

下面就郑强医生就新辅助治疗术后标本的一个规范化的取材以及病理学的评估进行一个详细的一个讲解。他也会展示一些精彩的病例。

郑强教授：
刚才李媛教授对于非小细胞肺癌的新辅助治疗相关的专家共识和指南进行了非常详尽的解读，接下来的部分将由我来为大家介绍非小细胞肺癌新辅助后相关病理评估的流程的一个讲解。

对于非小细胞肺癌的新辅助治疗后的病理反应评估，我们所需要关注的临床病理信息包括哪些呢？首先是患者相关的一些临床信息以及取材医生对于镜下的病理反应的评估，需要包括原始瘤床和淋巴结的评估以及病理分期和新辅助治疗规范化的病理报告，并且也关注新辅助免疫治疗后组织病理学的一些特征。临床医生在病理申请单上需要提供以下信息：患者是否进行过新辅助治疗以及新辅治疗的一些方案包括放疗、化疗、靶向治疗或免疫治疗等，单药或联合用药的治疗方案；必须注明治疗周期数及末次给药的日期；与治疗相关的肺炎史和其他可能影响肿瘤大小测量的相关病史，如结核、肺间质纤维化等基础性肺疾病；治疗前的组织学诊断，原始肿瘤位置及大小、手术类型；需注明影响临床病理分期的其他因素如心包、膈肌或胸壁等组织；对新辅助治疗疗效的临床和影像学评估结果也应一并给出。

一、识别瘤床
对于一线的病理取材医生来说，最为关键的和首要的就是识别肿瘤床。在各项文献和指南中瘤床是指治疗前原始肿瘤所在的部位。标本在送到病理科后在固定前需要辨认瘤床的位置。首先对于取材医生识别肿瘤床可寻找是否存在胸膜回缩处并仔细触诊标本；在难以识别和/或定位肿瘤的情况下，可回顾治疗前和术前CT可能会有所帮助；此外寻找外科医生所放置的标记或缝合线也有助于寻找瘤床。在确定肿瘤床后，应该对标本进行多切面切开，以显示瘤床的最大尺寸及其与分期和切除切缘相关的周围结构的关系。拍摄显示瘤床和邻近结构的切面，并将图像保存在电子病理系统中。应使用直尺评估瘤床的三维尺寸。并在大体描述中记录瘤床和切缘之间的距离。我们在肉眼大体取材时可估计坏死百分比，并与后续的镜下评估相对比，进一步校正坏死的百分比。

二、标本固定
在确定瘤床后对标本应进行充分的固定。常规肺癌手术标本的固定方式包括切开固定和灌注固定。由于进行新辅助患者的临床分期上处于相对晚期，肿瘤一般较大，为了固定充分而不影响后续评估相关的标志物的检测，本共识建议切开固定及平行于瘤床的最大面每隔0.5~1.ocm切开。瘤床若最大径小于3cm，按0.5cm间隔切开；大于3cm肿块则按1.0cm间隔切开；固定时间至少6小时，不超过72小时；下图则显示了肺癌新辅助标本CT的一个图像，显示在右上叶有0.8cm的肿块，大体切面上识别肿瘤床后，应将最大切面展开并且使用直尺测量，与CT图像进一步结合确定瘤床位置。

三、标本取材
在取材前首先应评估整个瘤床的坏死百分比和残存肿瘤的百分比，后续与镜下表现相结合进一步校正。取材的基本原则是最大径小于3cm者应全部取材；若大于3cm应选取代表性层面，通常为肿瘤最大切面。如最大切面未见明显肿瘤残存，则选取肿瘤残存较多的层面全部取材，其他层面选择可能为残存肿瘤处，至少每一层取一块。瘤床周边的取材需带有正常肺组织，以便于镜下进一步明确瘤床边界。有条件的单位在取材前应建议打印拍照取材标本的大体图片，在图片上做好组织块的标记。建议有条件的病理实验室尽可能多的取材以备后续的科研或临床研究的进一步需要。下图则非常简明扼要的说明了标本取材的送检和取材固定的流程。在这张示意图上可见将肿瘤进行多切面切开后，显示最大径为4cm的一个瘤床。按照共识的标准每隔1cm切开并依次排序，将肿瘤的最大切面全部取材并在图片上做好相应的记录，其他层面则至少取一块瘤床。边界取材需要带有正常肺组织。以下是本院的一些新辅助治疗后的手术标本的取材范例包括大体取材的图片。我们推荐在标本切开之后进行充分固定，选取尽量为白色、浅色或是深色的背景板，背景尽量不要有污渍或者血污的影响干扰，同时最好能够有相应的标尺或比例尺显示瘤床总的面积和大小。将标本多切面切开之后按照一定的顺序依次排开，可以使用一些专用的摄像设备。在一些没有条件的单位也可以使用手机或相机来拍摄，后续对图像加以处理，并将其存档，方便后续将大体取材的图片与镜下的切片进行一一对应，以校正和评估肿瘤退缩的比例。

四、瘤床的镜下判读
瘤床的镜下判读最为关键，根据上述专家共识和多学科的建议，结合术前和治疗前 CT 图像以及大体评估进行最大切面的一个取材，可以看到在这张大体图片上活性肿瘤与间质的炎症与纤维化交替，将肿瘤分为三个区域；在上图可以见到腺泡结构的残余活肿瘤细胞，邻近间质则可见慢性炎症和疏松黏液样结缔组织；残余的活肿瘤与瘤床中的纤维炎症间质常交替出现。那么瘤床的边界应该如何在镜下确定呢？上图可以显示在瘤床之外有显著的反应性边界，就是以黑线为界，黑线以内是一些残存的有活性的肿瘤，而在黑线以外可见大量反应性和炎症性的成分。肿瘤与正常肺组织之间的边界可以看到有明显的间质纤维化和炎症反应。在瘤床边缘的肺实质内可以看到间质纤维化，肺泡腔内可见泡沫样的组织细胞聚集，肺泡上皮可出现显著的反应性增生。在非肿瘤性肺实质的反应性增生的肺泡上皮周围可以看到显著的间质淋巴细胞浸润。部分病例在瘤床边缘和邻近肺实质中可见机化性肺炎。此外阻塞性肺炎可见肿瘤边缘的非肿瘤性肺实质内淋巴细胞聚集。

五、淋巴结病理反应的评估
对于病理医生来说淋巴结的病理评估实际上是存在一些困难和挑战的。因为在未经治疗的一些肺癌患者术后淋巴结内也常见一些反应性病变，包括如肉芽肿、纤维化和炭末沉积等，这样就给新辅助治疗后的淋巴结病理评估带来了一定的困难。且现有的共识和指南对于淋巴结评估方法还尚缺乏统一的标准。在共识中建议如下：对于送检淋巴结尽量全部取材，较大淋巴结可沿最大面剖开，如切面肉眼可见明确的瘤床需要测量肿瘤大小，并且按照原始瘤床取材原则，肿瘤最大面全部取材，其他层面可尽量多取材。此外应详细记录淋巴结内的病理改变，包括有无肿瘤细胞和治疗反应；对于淋巴结内肉眼可测量的瘤床建议按照原始瘤床的评估方法来进行评估。虽然淋巴结内残存的活性肿瘤细胞百分比，特别是淋巴结当反应达到MPR的临床意义尚不明确，但详细的评估和记录有助于数据积累和进一步的探索。新辅助治疗后，在无肿瘤细胞存活的淋巴结中，也会出现如坏死、肉芽肿和纤维化等改变，目前还尚无较好的方法鉴别是否为治疗反应。在排除其他疾病如结核等存在的前提下，特别是如果可观察到肿瘤坏死的轮廓或黏液样等物质，可描述提示为转移癌治疗后改变，但不应视为肿瘤残存。下面就是关于淋巴结内转移癌治疗后改变的一些示例图片。在A图中可以看到淋巴结内有活性的转移性腺癌；B图则显示了在淋巴结内大量的纤维间质反应背景下出现了无细胞性的粘液湖，因缺乏性活的肿瘤细胞，因此也被归类为ypN0；在一些肿瘤治疗反应相关的变化，同样也需要与淋巴结内本身存在的组织细胞、炭末沉积和纤维化相区分，这在实际工作中有时是非常困难。在高倍镜下可以看到这些组织细胞内充满了炭末的沉积。

六、残存或肿瘤细胞百分比计算

如何对残存活性的肿瘤细胞的百分比来进行计算，在不同的指南或专家共识中也提出了一些不同的评估方法，这些评估方法之间也存在一定的差异。在实际的病理评估报告中，各家医院对于瘤床的界定也存在经验上的差异。MPR是否包含淋巴结，是否应写出其真实的百分比数值或单纯标记MPR或pCR等，在病理报告中也存在一定的差异。目前我院对于新辅助治疗后的病理评估主要采取IASLC的多学科建议和专家共识指南来进行。对于所有带瘤床的切片进行阅片之后，如残存的活性肿瘤细胞百分比接近MPR或达到pCR时，需要对大体标本进行重新的检查，特别是如果在初步取材不够充分的情况下，需要进一步补取瘤床。当达到CPR时需要结合治疗前影像，已核实瘤床取材定位是否准确。而对于胶样癌，其特点是黏液湖中漂浮多少不等的肿瘤细胞，建议将残存的活性肿瘤与黏液湖一起视为残存的活性肿瘤细胞；如只有黏液湖而无活性肿瘤细胞成分则将其视为间质。最后是对于评估的记录，在实际的病理报告中，各家医院对于瘤床的界定及MPR是否包含淋巴结，写出实际的百分比或单纯标记pCR或非pCR的病理报告也存在差异。对原发肿瘤和淋巴结中各组成成分我们推荐它的评估结果要以百分比形式来进行记录，当评估高于10%时，每个组成成分以10%增量为记录；当结果低于或等于10%时，则以5%为增量记录。当未见组成成分时记录为0%；当切片无法评估时，评估结果报告为无法评估，并在报告单中填写原因并进行补充取材。本次我们提供了复旦肿瘤医院新辅后临床病理报告的格式化报告模板。报告中需要提供重要的临床病理信息包括患者的年龄、性别、病理号、住院号和送检日期、手术类型等等。此外标本类型、新辅助治疗类型如放疗、化疗或放疗联合免疫的治疗方案、大体描述、肿瘤所在部位、病理组织学类型，对于治疗反应的评估应在病理报告中加以详细的说明，评估其中活性肿瘤细胞占比是否可达到PCR或MPR。此外在病理报告中还应评估与手术切缘相关信息，如支气管切缘是否阳性，周围肺组织否存在其他病变以及是否有脉管或神经侵犯，周围组织是否累及，是否见胸膜侵犯或气道播散等。然后是对纵隔淋巴结转移情况的评估和记录，对于转移的淋巴结是否存在治疗相关反应也需在报告中加以说明和描述。

最后根据上述结果得出治疗后病理分期。如有相关的备注或加以说明者可在最后以备注或注释的形式体现。

最后一个环节就是结合本院新辅治疗后的一些实际临床案例来进行一个分享和讲解。首先是新辅后完全病理缓解的病例，此病例为右上肺的鳞癌进行了新辅助化疗联合免疫治疗。在右肺上叶经充分取材后未见肿瘤残留，经过上述解读完全病理缓解即CPR或PCR，指的是新辅助治疗后的瘤床内和淋巴结内均无残存的活性肿瘤细胞，如病理报告所示。值得注意的是，我们需要依据原发肿瘤和淋巴结内有无转移癌来评估整体的疗效。当原发灶残存肿瘤RVT等于0%，且淋巴结无转移，则评估为达到完全病理缓解。当原发灶和淋巴结任何一部分有存活肿瘤时，评估为未达到PCR。任何一方结果为无法评估时则判断为无法评估，需补充工作以进一步明确。下面我们展示了该病例的大体和镜下的代表性图像。病灶经过范多切面切开，可以见到在支气管肺门周围并未见明显的肿块残留或坏死灶，支气管旁有灰白灰黄质硬的呈纤维化样区域。在镜下同样能够看到在支气管周围有显著的间质纤维组织增生，同时伴有少量的慢性炎细胞浸润，局灶可见淋巴细胞聚集或三级淋巴结构的形成以及泡沫样组织细胞、巨噬细胞、多核细胞聚集，邻近肺组织可见纤维化和少量肺泡上皮增生，因此结合患者的大体和镜下表现，我们评估此病人达到了完全病理缓解即PCR状态。

第二个病例是新辅助免疫治疗后部分缓解即达到主要病理缓解MPR 状态。MPR在定义上是指新辅助治疗后瘤床内的残存活性肿瘤细胞的小于10%，无论淋巴结内有无活性肿瘤细胞，如左图的病理报告所示。经显微镜下评估含有瘤床的全部切片均应纳入RVT的计算，不含肿瘤床的切片则不纳入RVT计算。单个原发肿瘤RVT等于每张切片的存活百分比除以切片数，多个原发灶则分别计算每个肿瘤的RVT后取平均值，根据最终的RVT进行新辅助治疗后疗效评估。当RVT小于等于10%时，评估为达到MPR即主要病理缓解；当RVT大于10%时，评估为未达到主要病理缓解。当存在瘤床的任何一张切片无法评估时则判断为无法评估。下图为该病例的大体和镜下代表性图像，病灶经多切面切开，大体可见支气管周围有灰黄灰白区域，部分区域和肺组织分界不清，支气管腔部分闭塞。在镜下可见支气管周围有显著的肿瘤退缩反应，具有明显的间质纤维组织增生及慢性炎细胞浸润，局部可见泡沫样组织细胞聚集、多核巨细胞反应以及胆固醇结晶形成，可见淋巴滤泡及三级淋巴结构。虽然该病例瘤床中大部分区域可见肿瘤已经明显退缩，但我们依然在经过多切面切开和充分取材，我们在瘤床内依然可见少量多灶型分布的残存的岛屿状肿瘤细胞巢，可见异形性显著，周围有显著的淋巴细胞浸润及纤维组织增生，但经充分评估，残存的活性肿瘤细胞比例小于10%，因此我们判断为达到MPR状态。在病理报告中可见其纵隔淋巴结清扫见三枚淋巴结转移，其中可见大量的坏死角化物质及组织细胞和多核巨细胞反应，提示也同样具有显著的治疗后反应。

第三个病例是未达到主要病理缓解的一个病例。当治疗反应不明显时，在瘤床内可见大量的肿瘤细胞残存，仅见少量坏死或纤维组织增生等治疗相关改变。在对所有带瘤床的切片进行阅片之后，如残存活性肿瘤细胞百分比接近MPR或CPR时，我们需要对大体标本进行重新检查，特别是在取材不充分的情况下应进一步充分补取瘤床。当达到CPR时，则需要结合治疗前影像核实瘤床是否定位准确。而对于胶样癌，其特点是黏液湖中漂浮着多少不等的肿瘤细胞，建议将残存的活性细胞与黏液湖一起视为残存活性肿瘤细胞；如只有黏液湖则将其视为间质。下图则展示了该病例的大体和镜下图片，多切面切开在大体上我们能够见到在支气管及周围可见灰白质硬界不清区域。镜下同样可以见到支气管腔内有大量存活的肿瘤组织呈息肉样外观。在下图我们能够看到在活性的瘤巢周围见到有明显的肿瘤治疗退缩后的一个反应，大量泡沫样组织细胞聚集和胆固醇结晶的形成，在残存的岛屿状瘤巢周围见到有明显的纤维组织增生及慢性炎细胞浸润。因此经过评估此病例未达到MPR状态为病理学部分缓解。

以上是对新辅助治疗后病理标本案例分享以及流程详解的内容。接下来请李媛教授对本次课程进行总结。

总结
李媛教授：
这就是今天我们所要分享的关于肺癌新辅助治疗后术后标本病理评估的所有内容。从今天分享的内容我们可以看到对于术后的病理评估，实际还有一些亟待解决一些的问题，特别是以后有一些数字病例AI等人工智能的介入，可能会提高我们新辅助治疗术后评估的准确性以及效率。除了病理缓解程度的评估以外，还有一些分子生物学的方法包括MRD等等可能在肺癌新辅助治疗疗效的评估中会发挥的一些作用。总而言之对于肺癌的新辅助治疗病理评仍然需要继续的探索任重而道远。